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Expériences pour l'étude de la structure primaire de l'hirudine | |
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L'hirudine, protéine extraite des glandes salivaires de sangsue (anglais : "leech" - Hirudo medicinalis), inhibe l'action de la thrombine dans la coagulation du sang (conversion du fibrinogène en fibrine). L'effet inhibiteur est dû à une liaison spécifique de l'hirudine à la thrombine qui entraîne une inactivation irréversible de l'enzyme. Chang, J. Y. (1983) "The functional domain of hirudin, a thrombin-specific inhibitor" FEBS Lett. 164, 307 - 313 Dodt et al. (1984) "The complete amino acid sequence of hirudin, a thrombin specific inhibitor : Application of colour carboxymethylation" FEBS Letters 165, 180 - 184 |
La composition en acide aminés de l'hirudine (65 acides aminés) purifiée révèle des acides aminés particuliers :
La digestion de l'hirudine native par une aminopeptidase (EC 3.4.11.2) ne libère aucun acide aminé. |
La digestion de l'hirudine préalablement réduite et carboxyméthylée par la même enzyme permet la libération d'une valine. Quelles conclusions peut-on tirer ? |
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1. L'hirudine est une protéine trés acide comme l'indique la composition en acide aminé et le point isoélectrique. 2. Le fait qu'aucun acide aminé ne soit libéré après hydrolyse par l'aminopeptidase souligne un encombrement stérique autour de l'acide aminé N-terminal. Cet encombrement stérique peut-être dû à une conformation "globulaire" stabilisée un pont disulfure. On peut donc supposer qu'une cystéine se trouve proche de l'extrémité N-terminale dans la séquence en acides aminés. |
Visualisation de l'hirudine de Hirudo medicinalis obtenue par résonance magnétique nucléaire Code PDB : 5HIR Les ponts disulfure apparaissent en jaune. Remarques :
Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :
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| Cinétique de libération des PTH - acides aminés en position C-terminale |
La séquence C-terminale de l'hirudine est obtenue par action de la carboxypeptidase Y :
Une cinétique de libération identique est obtenue à partir de l'hirudine préalablement réduite et carboxyméthylée. Quelles conclusions peut-on tirer ? |
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La carboxypeptidase Y (EC 3.4.17.1) :
L'extrémité C-terminale de l'hirudine n'est donc pas bloquée par encombrement stérique puisque la carboxypeptidase Y peut agir. La séquence C-terminale de l'hirudine est : - X - Glu61 - Glu62 - Tyr63 - Leu64 - Gln65 - COOH |
| Marquage radioactif La séquence partielle de l'hirudine réduite et traitée à l'iodoacétamide radioactif a été déterminée par la méthode d'Edman. Les résultats correspondants aux résidus radioactifs sont présentés dans la figure ci-contre. La séquence N-terminale complète est : NH2 - V - V - Y - T - D - C6 - T - E - S -G - Q - N - L Quelles conclusions peut-on tirer ? |
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Les cystéines sont marquées par l'iodoacétamide. L'iodoacétamide et l'iodoacétate sont des réactifs des groupements thiols (-SH) :
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Les cycles où la radioactivité est détectée indiquent la position des Cys dans la séquences de l'hirudine. Celle-ci contient donc 6 Cys aux positions : 6, 14, 16, 22, 28 et 39. Remarque : la décroissance de la quantité de radioactivité détectée en fonction du nombre de cycle est dûe à la dénaturation des chaînes polypeptidiques à chaque cycle de dégradation (alternance de solution acide et basique, action du PITC, ...). Il y a donc de moins en moins de chaînes polypeptidiques susceptibles d'être traitées, donc de moins en moins de cystéine libérée. |
Séparation des produits de digestion de l'hirudine par chromatographie de filtration sur gel. (voir le domaine de fractionnement de ce type de gel) |
L'hirudine a été digérée par la protéase V8 (EC 3.4.21.19) qui hydrolyse spécifiquement la liaison peptidique du côté carboxyle des acides aminés Glu & Asp. Dans certaines conditions, la coupure se fait exclusivement après Glu. Parmi les produits de digestions majeurs, deux ont été détectés après séparation par chromatographie de filtration sur gel.
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Quand la liaison peptidique est formée, il y a élimination d'une molécule d'eau (18 Da). La masse molaire d'un résidu d'acide aminé est donc, en moyenne : MM = 140 Da - 18 Da = 122 Da. 65 acides aminés correspondent à une masse molaire pour l'hirudine d'environ 7930 Da. D'après la droite d'élution on détermine :
On peut supposer que la protéase V8 coupe la liaison (voir séquence ci-dessous) : Val1 ------ Glu43 / Gly44 ------ Gln65 |
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Digestion par la trypsine Un peptide isolé après digestion partielle de l'hirudine (préalablement réduite) par la trypsine a la composition en acides aminés suivante : 2N, 3Q, 1C, 1V, 2T, 3G, 5E, 3P, 1K, 1S, 1H, 2D, 1F, 1I, 1Y, 1L. La Tyr est sulfatée. De quel fragment s'agit-il ? La trypsine (EC 3.4.21.4) coupe la liaison peptidique après Arg et Lys. Comme l'hirudine ne contient que 3 Lys (et pas d'Arg), il n'y a que 3 sites de coupures potentiels. La digestion est partielle, il n'y a donc que 1 ou 2 coupures. En conséquence, 2 ou 3 fragments sont générés après hydrolyse. |
| La Tyr est sulfatée (Tyr63).
C'est donc un peptide du côté
C-terminal.
Il ne contient qu'une seule Cys. Celle-ci ne peut-être que la Cys39. L'avant-dernière Cys étant en position 28, il faudrait une Lys en position 29. Le peptide ne peut commencer qu'en position 30. |
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Le peptide isolé fait 29 acides aminés. C'est donc l'un des suivants : [30--> 58] ou [31--> 59] ou [32--> 60] ou ... [37--> 65]. Le peptide isolé contient une Lys. Ce site n'a donc pas été coupé par la trypsine. Le peptide isolé contient la Tyr sulfatée (Tyr63) et il n'y a pas de Lys après cette Tyr. En conséquence il s'agit du fragment [37--> 65]. |
| Hirudine | Inhibition de la thrombine | Interprétation |
| native | 100 % | Témoin positif |
| réduite | 10 % |
Sans pont disulfure, l'hirudine perd sa structure native (mais n'est pas dénaturée). Les 10 % résiduels sont les molécules non complètement réduites. |
| désulfatée 60% | 87 % |
La Tyr63 est de plus en plus désulfatée. Indique l'importance d'au moins une charge négative du côté C-terminal pour l'interaction avec la thrombine. |
| désulfatée 100% | 45 % | |
| réduite + protéase V8 | 3 % |
L'hirudine est sous la forme de 2 fragments (1 - 43 et 44 - 65) sans pont disulfure. Souligne que l'interaction avec la thrombine se fait du côté C-terminal mais aussi du côté N-terminal. |
| native + carboxypeptidase Y (20 min) | 8 % |
L'hirudine n'a plus l'extrémité C-terminale : - Glu62 - Tyr63 - Leu64 - Gln65 - COOH. Souligne l'importance d'un ensemble de charges négatives du côté C-terminal pour l'interaction avec la thrombine. |
| après estérification des COOH | 0 % |
Toutes les charges négatives ont disparu (formation d'ester). Confirme le résultat ci-dessus. Estérification : R - COO- + R' - OH ---> R - CO- O - R' + H2O |
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Séquence en acide aminés de l'hirudine de sangsue (Hirudo medicinalis) - 65 acides aminés - La tyrosine 63 est sulfatée. >gi|231142|pdb|5HIR| Hirudin (Wild-Type) VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ |
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