Méthodes d'étude de la cellule et des macromolécules biologiques

1. Synopsis général des techniques

2. L'adhésion entre cellules (desmosome, cadhérines)

3. La technique de cryofracture

4. Les techniques de centrifugation

5. Les techniques immunochimiques

6. Les techniques de fluorescence pour l'hybridation in situ

7. Les structures des macromolécules biologiques et certaines techniques pour les étudier

a. Conditions de lyse de bactéries pour la purification d'une protéine recombinante

b. Gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes

c. Chromatographie de gel de filtration ou tamis moléculaire ou d’exclusion stérique

d. Le dichroïsme circulaire

e. Détermination de la structure tridimensionnelle par cristallographie et diffraction des rayons X

f. Décryptage de mécanismes moléculaires à partir des structures tridimensionnelles : le photosystème II

8. Synthèse des protéines

9. Dégradation des protéines - ubiquitine et protéasomes

10. Liens Internet et références bibliographiques

1. Synopsis général des techniques pour aller de l'observation des tissus à la purification et l'analyse des macromolécules biologiques

Cristalographie - diffraction des rayons X et résonance magnétique nucléaire

détermination de la structure tridimensionnelle des macromolécules

Principe

La cryofracture révèle la localisation des protéines membranaires.

En effet, selon qu'elles sont intrinsèques ou extrinsèques, volumineuses ou pas, les protéines restent attachées à une face de la membrane ou à une autre.

La fracture suit le milieu de la bicouche lipidique qui est la région de la membrane offrant le moins de résistance.

Technique

• l'échantillon à étudier est vitrifié en étant plongé à -170°C (azote liquide) ou -200°C (propane liquide).
• l'échantillon est fracturé en deux parties. La ligne de fracture passe par les zones de moindre résistance : la zone hydrophobe de la bicouche lipidique de la membrane.
• un alliage de platine et de carbone est chauffé afin d'obtenir un gaz de particules. Le mélange est projeté sur la surface fracturée, avec un angle de 45°. Le métal se dépose avec une épaisseur qui varie selon le relief de la surface : on obtient une réplique de la surface fracturée.
• une couche uniforme de carbone est vaporisée à 90° afin d'augmenter la résistance mécanique de la réplique.
• l'échantillon couvert de sa réplique de [platine / carbone] et de carbone est refroidi, nettoyé puis dŽposé sur une grille de microscope électronique à transmission. La finesse des grains de [platine / carbone] (de l'ordre de 5 nm) détermine la résolution de l'image.

Le carbone est traversé par les électrons mais le platine les arrête plus ou moins totalement selon l'épaisseur rencontrée par le faisceau d'électrons. Un film photographique traduit les informations sur le relief en contraste de gris :

• zones noires : le platine s'est accumulé
• zones blanches : pas de platine
• zones grises (sans relief) : le platine s'est réparti de manière uniforme

Source : "Cryofracture" (CNRS)

Application à l'étude du chloroplaste

Les chloroplastes ont deux membranes (interne et externe) bordant une zone aqueuse appelée stroma (siège de la phase sombre de la photosynthèse).

Le stroma contient la membrane thylacoïde (siège de la phase diurne).

La membrane thylacoïde est plissée en un réseau de nombresuses vésicules aplaties qui prend la forme :

• soit d'empilements compacts appelés grana (granum)
• soit de vésicules isolées et libres dans le stroma et réunissant plusieurs grana

Les parties de membrane thylacoïde :

• situées au sein des grana et sans contact avec le stroma sont les lamelles des grana
• accessibles au stroma sont les lamelles du stroma

L'espace interne enclos par la membrane thylacoïde est le lumen.

Source : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994)

Comparer cette figure "théorique" aux clichés obtenus par cryofracture du site : "La structure du chloroplaste" - Equipe multimédia - Université Jussieu

4. Les techniques de centrifugation

Certaines méthodes de centrifugation permettent d'étudier les structures sub-cellulaires. Un exemple d'application est l'étude du trafic intracellulaire ou la purification des mitochondries qui sont séparées des noyaux.

La vitesse de sédimentation d'une particule (organite, macromolécule, ...) est fonction de la différence entre sa densité et celle du milieu ambiant.

Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique qui doit être très solubles dans l'eau. pers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients.

La vitesse de sédimentation peut donc être modifiée en faisant varier de façon continue ou discontinue (par paliers) cette différence en créant un gradient de concentration du milieu ambiant.

• 1er cas : aucune différence de densité, il n'y a pas de sédimentation quelle que soit l'accélération.
• 2ème cas : la densité de la particule est plus grande que celle du milieu ambiant : il y a sédimentation d'autant plus rapide que la différence de densité est grande.
• 3ème cas : la particule s'élève jusqu'à ce qu'elle atteigne une densité du milieu ambiant identique à la sienne (elle peut éventuellement flotter).

Source : "Centrifugation en gradient de densité"

b. Centrifugation différentielle

Elle permet de séparer les particules (organites, macromolécules, ...) en fonction de leur taille par une succession de centrifugations à des temps et des accélérations croissants.

Ci-contre, un protocole de purification de différents organites de la cellule.

Source : "Purification by Differential Centrifugation"

Voir une animation didactique (Académie Aix - Marseille)

Le but de l'immunochimie est de révéler une molécule biologique présente sur une cellule ou un tissu avec des anticorps spécifiques.

• immunohistochimie : l'échantillon est une coupe de tissu
• immunocytochimie : l'échantillon est une préparation cytologique

Principe : un anticorps primaire est fixé sur un antigène. On révèle cet anticorps avec un second anticorps dirigé contre la classe d'immunoglobuline à laquelle appartient l'anticorps primaire.

Des particules d'or ("immunogold") ou une enzyme qui catalyse une réaction colorimétrique (exemple : la peroxydase) sont fixées sur l'anticorps secondaire.

Ci-dessous, schéma d'un dosage immuno-enzymatique ("enzyme-linked immunoassay" ou EIA).

Le milieu de développement de la chimiluminescence contient du luminol (3-aminophthalhydrazide), du 4-iodophenol et de l'eau oxygénée.

Des radicaux libres sont formés par l'action de la peroxydase sur l'eau oxygénée.

Ces radicaux libres réagissent avec le luminol qui émet alors des photons de fluorescence de longueur d'onde 425 - 445 nm.

Des techniques de couplage à l'enzyme de révélation permettent d'augmenter la sensibilité du dosage en diminuant la limite de détection.

L'une d'entre elles consiste à fixer plusieurs molécules de biotine sur l'anticorps. La biotine est ensuite reconnue par la streptavidine (sur laquelle est fixée la peroxydase) avec une trés haute affinité.

Il existe quatre niveaux de structure des protéines :

• la structure primaire : c'est la séquence en acides aminés ou enchaînement polypeptidique
• les structures secondaires : c'est l'ensemble des structures locales spécifiques qu'adoptent certaines parties d'une protéine. C'est une étape du repliement des protéines
• la structure tertiaire ou structure tridimensionnelle : parmi les innombrables structures que peut adopter une protéine, c'est la seule structure qui lui confère sa fonction biologique
• la structure quaternaire : certaines protéines sont constituées de plusieurs chaînes polypeptidiques (appelées sous-unités) identiques ou non. La structure quaternaire est l'arrangement spatial de ces différentes sous-unités

Les souches E. coli B834(DE3)pLysS sont cultivées à 37°C sur milieu Luria Bertani (LB) en présence d'antibiotiques : carbénicilline plus chloramphénicol (la résistance au chloramphénicol étant conférée par le plasmide pLysS).

L'expression de la protéine recombinante est induite par l'addition d'isopropylthiogalactoside (IPTG) quand la culture des bactéries atteint une densité optique A₆₀₀ = 0,41.

Les bactéries sont centrifugées 15 min à 6000g et le culot bactérien est resuspendu dans un tampon de lyse constitué de : Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 ; EDTA 1 mM ; PMSF 1 mM ; NaCl 100 mM ; sarcosine 0,2% ; lysozyme 0,25 mg/mL ; DNase I 60 unités.

Ce mélange est incubé 2 heures à 37°C puis le lysat est centrifugé 40 min à 15000 g.

Rôle des composants du milieu de lyse

Le but est de déstructurer la membrane bactérienne.

1. l'éthylène diamine tétraacétate (EDTA), chélateur de cations palents, inhibe les métalloprotéases et joue aussi un rôle d'antioxydant.

2. le phénylméthanesulfonyl fluorure (PMSF) inhibe les protéases à sérine.

3. l'augmentation de la force ionique par le NaCl (µ = 0,1 M) diminue les interactions électrostatiques entre les protéines et les autres constituants de la membrane.

4. la sarcosine est un détergent qui dissout les lipides.

5. le lysozyme hydrolyse les liaisons osidiques

Source : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994)

Figure ci-contre : cellule d'E. coli 6 heures après l'induction de l'expression de la chaîne lourde de l'anticorps MAK33.

Le corps d'inclusion est la structure amorphe en gris clair, à droite.

Source : Lilie et al. (1998) Curr. Opin. Biotech. 9, 497 - 501

Le principe du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis", SDS-PAGE) est de traiter un mélange de protéines avec :

• un agent réducteur, le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures
• et un détergent anionique, le sodium dodecyl sulfate qui dénature les protéines et leur confère une enveloppe de charges négatives

Les protéines sont donc sous une forme monomérique.

Les protéines de l’échantillon sont ensuite séparées par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à un certain pourcentage.

La migration s'effectue sous l'action d'un champ électrique (la flèche de la figure ci-contre indique le sens de migration).

Une protéine migre d'autant moins que sa masse molaire est élevée.

Les protéines sont fixées dans le gel est révélées par une coloration (exemple : le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argent). On obtient les différentes bandes de chaque piste de la figure ci-contre.

La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des protéines standards de masses molaires connues (piste de droite) :

Exemple : phosphorylase β (97 kDa), albumine (66 kDa), ovalbumine (45 kDa), anhydrase carbonique (30 kDa), inhibiteur de trypsine (20,1 kDa), α lactalbumine (14,4 kDa).

Cette technique permet de :

• déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et leur masse molaire respective
• de se rendre compte du degré de purification d'une protéine

Voir un développement de cette technique

Ce type de chromatographie permet de séparer les protéines et de déterminer leurs masses molaires.

Pour celà, il faut calibrer le gel et obtenir une droite de calibration.

Un mélange de protéines standards de masses molaires connues sont séparées (figure ci-contre) dans les mêmes conditions que les protéines de l’échantillon.

Exemple : thyroglobuline (669 kDa), ferritine (440 kDa), catalase (232 kDa), lactate déshydrogénase (140 kDa) et albumine (66 kDa).

Le profil d’élution est tracé après mesure d’absorbance à 280 nm des fractions éluées.

• le volume d’élution Ve de chaque protéine de référence est déterminé
• le bleu Dextran (2.10⁶ Da) permet de déterminer le volume mort Vo du gel

La droite de calibration est : Ve/Vo = f (log PM) (figure ci-contre).

Les protéines de l’échantillon sont ensuite séparées dans les mêmes conditions et l’absorbance à 280 nm des fractions éluées est mesurée.

Par comparaison avec la droite étalon, on peut ainsi déterminer la masse molaire des protéines.

d. Le dichroïsme circulaire

Le dichroïsme circulaire s'appuie sur la capacité des molécules qui ont une activité optique : propriété d'absorber différemment la lumière polarisée (circulairement à droite et circulairement à gauche).

Le dichroïsme circulaire est une technique qui permet d'analyser le contenu en structures secondaires des protéines ou des acides nucléiques.

Cette une technique non destructive qui permet d'étudier les changements de conformation des protéines dans différents environnements (pH, agents dénaturants, température).

Pour déterminer la proportion de chaque type de structure secondaire, il faut effectuer une déconvolution en composantes élémentaires du spectre de dichroïsme circulaire avec des logiciels appropriés.

La forme du spectre de dichroïsme circulaire obtenu pour une protéine peut-être le suivant :

• hélice α
• feuillet β
• structure non ordonnée

Chaque composante donne une courbe spectrale caractéristique.

e. Détermination de la structure tridimensionnelle par cristallographie et diffraction des rayons X

La cristallographie est la science qui se consacre à l'étude des substances cristallines à l'échelle atomique. L'état cristallin est défini par un caractère périodique et ordonné à l'échelle atomique ou moléculaire (maille élémentaire).

La cristallogénèse est la formation d'un cristal, soit en milieu naturel, soit de façon expérimentale. C'est le passage d'un état désordonné liquide à un état ordonné solide, contrôlé par la température, la pression, le temps d'évaporation et des lois cinétiques complexes.

Les macromolécules biologiques sont souvent très difficiles à cristalliser.

C'est par cristallographie que J. Watson, F. Crick, M. Wilkins et R. Franklin ont pu déterminer la structure en double hélice de l'ADN en 1953 (Prix Nobel en 1962).

J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel ont reçu le Prix Nobel en 1988 pour la détermination de la structure d'une protéine membranaire aussi complexe que celle du centre réactionnel P680 de la bactérie Rhodopseudomonas virdis (figure ci-contre).

Cette structure a permis d'établir l'ordre des évènements et les temps pour chacun d'entre eux (figure ci-dessous). Elle illustre parfaitement la notion de stabilisation de la différence d'énergie qui s'opère par le mécanisme de séparation des charges.

"Principes de Biochimie" Horton et al. (1994) - De Boeck Université - ISBN : 2-8041-1578-X

J.-C. CALLEN - "Biologie Cellulaire" (1999), Ed. DUNOD - ISBN : 2 10 003197 X

Lilie et al. (1998) Curr. Opin. Biotech. 9, 497 - 501

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