Extraction des ARN totaux
voir Matériel & Méthodes
Pour chacun des 2 temps d’imbibition (12 h et 22 h), les ARN totaux ont été extraits à partir de 4 g de graines entières de pois. Ceux de Medicago truncatula ont été gracieusement fournis par G. Glevarec (équipe "Métabolisme Azoté").

a. Mesures d'absorbance

La concentration des ARN totaux et l'éventuelle contamination par d'autres types de macromolécules sont déterminées en mesurant l'absorbance à trois longueurs d'onde :

  • 260 nm (253 nm < lmax < 271 nm) : longueur d'onde moyenne d'absorbance maximale des ribonucléotides 5'-monophosphate (voir leurs propriétés optiques). La concentration des acides nucléiques est calculée à partir de la relation : 1 unité d'absorbance à 260 nm = 40 µg/mL
  • 277 nm : contamination par les protéines à pH 7 (lmax du noyau indole des Trp) et les polyphénols
  • 230 nm : contamination par les polysaccharides
Matériel biologique
imbibition
concentration ARN totaux
contaminations
volume (µL)
A260
concentration (µg/mL)
A277
A260 / A277
A230
A260 / A230
Pisum sativum
12 h
2000
0,239
976
0,114
2
0,121
1,97
22 h 
2000
0,129
528
0,063
2,04
0,074
1,74
Medicago truncatula
10 h
500
0,136
270
0,091
1,49
0,075
1,81
30 h 
500
0,281
556
0,186
1,51
0,152
1,84

Les valeurs indiquent une faible contamination par les protéines / polyphénol pour Pisum sativum et une faible contamination par les polysaccharides pour tous les échantillons (sauf Pisum sativum 22h).

 

spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 12 h

spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 12 h
b. Gels électrophorèse (agarose 1%) en conditions dénaturantes (voir des ARN totaux "qualité commerciale")

 

 

Pisum sativum

légère contamination ADN génomique --->

 

 

ARN ribosomique 28 S --->

ARN ribosomique 18 S --->

 

 

 

 

courts fragments : hydrolyse partielle (RNases) --->
A
 
B
  • A : imbibition 22 heures - 4 µg
  • B : imbibition 12 heures - 8 µg

 

 

Medicago truncatula

 

ARN ribosomique 28 S --->
 

ARN ribosomique 18 S --->

A
B
C
D
  • A : axes embryonnaires imbibés 10 heures
  • B : cotylédons imbibés 10 heures
  • C : axes embryonnaires imbibés 30 heures
  • D : cotylédons imbibés 30 heures