Le principe du système utilisé repose sur la méthode décrite par Okayama & Berg (1982) et les modifications apportées par Gubler & Hoffman (1983).

a. Synthèse du premier brin

• la première étape est l'hybridation entre l'amorce oligo(dT) et la queue Poly-A⁺ des ARNm avec un rapport optimal [amorces oligo(dT):ARNm] (volume:masse) de 0.5 µl par µg ;
• le tableau suivant indique les volumes utilisés pour chaque matériel biologique :

• les ARNm et les amorces oligo(dT) (0,5 µg/µL) sont incubés 10 min à 70°C (linéarisation des acides nucléiques) puis le mélange est immédiatement mis à 0°C pour éviter tout repliement des ARNm ;

• la seconde étape est la rétro - transcription des ARNm en ADN simple brin, catalysée par la réverse trancriptase à 42°C pendant 1 h. Au mélange [amorces oligo(dT):ARNm] sont ajoutés :

1. 5 µL de tampon de synthèse du premier brin : Tris-HCl 250 mM, pH 8,3 ; KCl 250 mM ; MgCl₂ 50 mM ; DTT 50 mM ; spermidine 2,5 mM ; dATP - dCTP - dGTP - dTTP 5 mM chacun ;
2. un inhibiteur de ribonucléases 40 U ;
3. 2,5 µL pyrophosphate de Na 40 mM ;
4. AMV réverse trancriptase 30 U (AMV : Avian Myeloblastosis Virus) ;
5. un volume d'eau - DEPC tel que le volume final soit de 25 µL.

b. Synthèse du second brin

• elle s'effectue à 14°C pendant au moins 2 h (3 à 4 h pour des ADNc de taille supérieure à 3 kb). Au milieu de synthèse du premier brin sont ajoutés :

1. 50 µl de tampon de synthèse du second brin (Tris-HCl 100 mM, pH 7,2 ; KCl 225 mM ; MgCl₂ 7,5 mM ; BSA 0,125 mg/ml ; DTT 7,5 mM) ;
2. ADN polymérase I 23 U ; RNase H 0,8 U) ;
3. un volume d'eau - DEPC tel que le volume final soit de 125 µL.

• un choc thermique de 10 min à 70°C arrête la réaction. La synthèse du second brin est achevée à 37°C pendant 10 min par la T₄ DNA polymérase (2U par µg d'ARNm). La réaction est arrêtée en ajoutant 10 µL EDTA 200 mM.

c. Purification des ADNc

• les ADNc sont purifiés par une extraction des enzymes au phénol:chloroforme:AIA (125:24:1) suivie d'une centrifugation (12000 g, 2 min) ;

• les ADNc (phase aqueuse) sont précipités par addition de 0,5 volume d'acétate d'ammonium 7,5 M et de 2,5 volumes d'éthanol 96 % puis centrifugés (12000 g, 5 min). Le culot est lavé à l'éthanol 70 % puis centrifugé (12000 g, 5 min) ;

• enfin, le culot contenant les ADNc purifiés est repris dans 10 à 20 µL de TE 10:1.

L'efficacité de synthèse des ADNc a été évaluée par une amplification RPC en utilisant différents couples d'amorces :

• GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3)
• EF1a : facteur de transcription
• GS1a : isoforme 1 cytosolique de la glutamine synthétase de Medicago truncatula
• GS : isoforme cytosolique de la glutamine synthétase de Pisum sativum
• Voir les séquences des amorces

d. Bibliographie

• Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) "A simple and very efficient method for generating cDNA libraries" Gene 25, 263 - 269
• Okayama, H. & Berg, P. (1982) "High-efficiency cloning of full-length cDNA" Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170