Applications et résultats de la protéomique : exemple de la RuBisCO

Aller à SWISS-2DPAGE . Dans le menu "Search by" (en haut à de gauche), choisir "[accession number] ".

Dans la fenêtre "Search by accession number or by entry name (AC or ID)", taper le numéro d'accesion : O03042.

Commenter les résultats.

Ouvrir l'image du gel 2D :

• Combien y a-t-il de spots ?
• A quoi correspondent-ils ?
• Quelle différence y a-t-il entre ces protéines ?

Aller à la base de données PPDB : "The Plant Proteome Database".

Choisir : "Protein Function".

Ouvrir l'arborescence (signe "+") : "1 PS (1313)" puis "1.3 PS. calvin cyle (229)".

Sélectionner : "1.3.1 PS. calvin cyle.rubisco large subunit (16)" puis "ATCG00490.1".

De quel travail sont issues les données de protéomique concernant les protéines de l'enveloppe totale des chloroplastes ?

"Published Proteomics Data" 12766230

Ferro et al. (2003) "Proteomics of the Chloroplast Envelope Membranes from Arabidopsis thaliana" Molec. Cell. Proteomics 2, 325 - 345

D'après cet article, quel est le pourcentage de protéines localisées dans les membranes, les thylacoides, le stroma ?

Revenir à PPDB. Ouvir le lien "Get sequence" dans la partie "Links" (haut de la page).

Récupérer et enregistrer la séquence FASTA.

Ouvrir une nouvelle page de navigateur.

Lancer le programme d'alignement FASTA (EBI) avec la séquence enregistrée . Optimiser les paramètres de l'alignement.

Commenter les résultats.

Cours matrices

Ouvrir une nouvelle page de navigateur et choisir l'outil "MS-Digest" de la suite logicielle "Protein Prospector".

Coller la séquence FASTA BRUTE dans la fenêtre du bas "User Protein Sequence".

Cliquer sur "perform digest" pour effectuer l'hydrolyse in silico de la protéine.

Paramètres à ajuster :

• choisir "User protein" dans le menu "Database".
• supprimer le N° d'accession dans la fenêtre "List of Entries".
• choisir "Trypsin" dans le menu "Digest".
• choisir "ESI_Q_TOF" dans le menu "Instrument".

Rechercher le peptide DLAVEGNEIIR et cliquer sur le lien.

• Quelle est la masse moyenne de l'ion [M+H]⁺ ?
• Quels types d'ions N-terminaux et C-terminaux la fragmentation de ce peptide génère-t-elle ?

Revenir à la base de données PPDB. Dans la partie "Experimental Evidence", cliquer sur "Details" du chiffre "107".

De quel organisme, de quel organe et de quel compartiment proviennent les données ?

Cliquer sur le lien "SeqView" du "spot" N° 53.

• Quel peptide a été identifié ?
• Par quelle méthode de spectroscopie ?
• Par quelle protéase a-t-il été généré ?
• Quelle est la charge de l'ion ?

Enregistrer ce peptide au format FASTA. Dans une autre page de navigateur, aller à la liste des outils de l'EBI.

Lancer "ClustalW2" : aligner la séquence de la grande sous-unité avec le peptide. Le résultat vous parait-il cohérent ?

Revenir à la base de données PPDB. Dans la partie "Related Genes", repérer la séquence Os12g10580.1.

De quel organisme s'agit-il ? Que vaut la E-value ?

Que signifie la E-value qui vaut zéro dans ce tableau pour Osp1g00420.1 de Oryza sativa en regard de la séquence ?

Quels critères indiquent le meilleur alignement dans ce tableau ?

Récupérer la séquence Os12g10580.1 au format FASTA.

Aligner cette séquence avec celle de la grande sous-unité de la RuBisCO de Arabidopsis thaliana.

• Sur quelle partie les deux séquences s'alignent-elles le mieux ?
• Est-ce cohérent avec les résultats du tableau ?

Os12g10580.1

1 - 245 aa / oui

Aligner les 3 séquences : grande sous-unité de Arabidopsis thaliana, grande sous-unité de Oryza sativa et le peptide DLAVEGNEIIR. Le résultat est-il étonnant ?

Remarque : utiliser différentes matrices et modifier les paramètres des gaps afin de trouver le meilleur alignement.

Faire un autre alignement en ajoutant le peptide : LTYYTPEYETK.

• Où se situe ce peptide dans la séquence ?
• A quelle expérience et à quel spot correspond-il ?

Aller dans la catégorie "Proteomics" des outils de "Expasy".

Choisir "Translate" (tout en bas de la liste, à droite).

Coller la séquence FASTA "U91966.fasta" dans la fenêtre et lancer l'application.

Attention : supprimer tout le texte qui n'est pas la séquence proprement dite.

Que signifie "5'3' Frame 1", "5'3' Frame 2", ... ?

L'une des traductions vous semble-t-elle cohérente ?

Aller à la page de "ORF Finder" du NCBI. Taper le n° d'accession "U91966.1" et lancer l'application.

Rechercher la phase de lecture ouverte la plus cohérente.

Quelle longueur fait-elle en nucléotides et pour combien d'acides aminés code-t-elle ?

Récupérer la séquence nucléotidique FASTA :

• cliquer sur le carré vert à côté de "+2"/ cliquer sur "Accept"
• dans le menu déroulant qui commence par "1 GenBank", choisir "2 Fasta nucleotide" / cliquer sur "View"
• enregistrer cette séquence FASTA

Revenir au programme "Translate".

Coller la séquence FASTA "ORFframe2.fasta" dans la fenêtre et lancer l'application.

• cliquer sur la bonne phase de lecture
• cliquer sur la méthionine en position 1
• cliquer sur le lien "VIRTXXXX in FASTA format"

Enregistrer la séquence FASTA virtuelle générée.

5'3' Frame 1

Virtuelle.fasta

Dans une autre page de navigateur, aller à "Pairwise Sequence Alignment". Choisir "Water (EMBOS)".

Que fait ce programme ?

En optimisant les paramètres, aligner la séquence FASTA "RLSAT.fasta" avec la séquence FASTA "Virtuelle.fasta".

Quelle différence y a-t-il entre "RLSAT.fasta" et "Virtuelle.fasta" ?

Finalement à quoi correspond la séquence U91966.fasta ?

"Virtuelle.fasta" est la séquence protéique du précurseur de la grande sous-unité de la RuBisco de Arabidopsis thaliana "RLSAT.fasta".

"U91966.fasta" est la séquence génomique de la grande sous-unité de la RuBisco de Arabidopsis thaliana.

ExPASy Proteomics tools : Ensemble d'applications pour l'analyse de séquences peptidiques.

Bioinformatics Databases and Tools Guide : Liste d'un trés grand nombre d'applications bioinformatiques, de bases de données et autres classées par catégories.

Sequence Manipulation Suite : Ensemble d'applications Java pour l'analyse de séquences d'ADN et de protéines.

"ProMEX : Protein Mass spectra EXtraction" : base de données de spectres de masse d'ions obtenue après hydrolyse tryptique et générés par spectrométrie de masse à piège à ion couplée à la chromatographie liquide - Arabidopsis thaliana.

"Arabidopsis thaliana Seed Proteome" (CNRS - INRA - Bayer)