Puces à ADN : analyse de l'article de Seki et al. (2002)

1. Caractéristiques et apports de l'étude

2. Obtention d'ADNc pleine longeur ("full-length cDNA")

3. Caractéristiques de la puce

4. Vérification des données issues de la puce à ADN par Northern blot

5. Résultats généraux

6. Exemple de résultats concernant un gène inductible par l'acide abcissique (ABA)

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. Caractéristiques et apports de l'étude

a. Travail collossal : construction de plusieurs banques d'ADNc pleine longueur d'Arabidopsis thaliana ===> fabrication d'une puce contenant 7000 ADNc pleine longueur.

Ils ont été isolés à partir d'une série de banques d'ANc obtenues (p284 - "Results and discussion") :

• avec la plante non stressée
• après un traitement à l'ABA, au froid, à la dessication (déshydratation)
• et ce, à différents stades de développement (de la germination à la la graine mature)

Remarque : actuellement plus de 15.000 ADNc pleine longueur dans la base de données du consortium "RIKEN".

b. Etude de différents traitement ou stress : voir un cours

• acide abcissique (ABA)
• sècheresse ("drought")
• froid ("cold")
• forte salinité ("high salinity")

c. Profil d'expression : étude cinétique (6 temps) de 0 à 24 heures d'application de ces stress.

c. Travail exigeant : seuls les gènes ayant un rapport d'expression supérieur à 5 [(log2(r)] sont analysés.

d. Travail trés précieux pour la communauté scientifique :

• fabrication de puces à ADNc pleine longueur
• analyse des effets croisés de 4 stress abiotiques
• étude cinétique (6 temps) des profils d'expression
• étude directe ou indirecte de séquences de promoteurs et de séquences de régulation post-transcriptionnelle par comparaison des séquences d'ADNc pleine longueur et des séquences des génes d'Arabidopsis thaliana
• identification de 22 gènes codant des facteurs de transcription régulant l'expression de gènes impliqués dans des voies de transduction du signal de l'ABA
• éléments de description des interactions entre les gènes impliqués dans les voies de signalisation liées aux stress étudiés
• ensemble des données compilées, stockées et accessibles dans la base de données du consortium "RIKEN"

Principaux résultats de cette étude

1. Analyse cinétique des effets croisés de stress biotique et abiotiques.

2. Identification de 22 gènes codant pour des facteurs de transcription liés à la voie de signalisation de l'ABA.

3. Plusieurs mécanismes de la régulation de la transcription sont impliqués dans la voie de transduction du signal de l'ABA.

4. Il y a davantage de points communs entre les gènes impliqués dans la voie de signalisation de l'ABA et celles liées à la sécheresse et à une forte salinité qu'entre la voie de signalisation de l'ABA et celle liée au froid.

L'acide abcissique ("abscisic acid" - ABA) a été identifié en 1963 par F. Addicott et ses collaborateur, à partir des feuilles de cotonnier.

C'est une hormone végétale synthétisée par les racines ou les feuilles (à l'intérieur des plastes).

Structure : sesquiterpène - terpène dérivé de l'isoprène, composé en C15.

Exemples de rôles de l'ABA

L'ABA est un messager capital de nombreuses voies de transduction du signal en réponse à des stress biotiques et abiotiques (exemple : limiter le stress hydrique en période de sécheresse).

Figure ci-contre, illustration du rôle de l'ABA dans l'ouverture de canaux ioniques.

Autres rôles physiologiques :

• inhibition de la germination des graines
• inhibiteur général de la croissance cellulaire
• régulation de la dormance des bourgeons et des graines
• régulation de l'abscission des feuilles, des fleurs et des fruits
• régulation du fonctionnement des stomates en situation de stress

Source : Raghavendra et al. (2010)

2. Obtention d'ADNc pleine longeur ("full-length cDNA") (Carninci et al. - 1996)

Un groupe biotine est fixé sur les groupes diol de la coiffe 5' et de l'extrémité 3' des ARNm. Cette fixation est faite en 2 étapes.

(A) Le premier brin d'ADNc est synthétisé.

La RNAse I hydrolyse les ARN simple brin mais pas les hybrides ARNm / ADNc. La RNAse I enlève les groupes biotine :

• de l'extrémité 3' de la queue poly(A) de tous les ARNm non protégés par l'amorce pour la transcription inverse
• de la coiffe 5' des hybrides dont le premier brin ADNc est incomplet

(B) Capture des ADNc pleine longueur par des billes magnétiques recouvertes de streptavidine.

Récupération des ADNc fixés aux billes par digestion des ARNm par la RNAse H.

Hybridation d'amorces oligo(dG) au premier brin d'ADNc pour la synthèse du second brin d'ADNc et hybridation avec les adaptateurs.

(C) Synthèse du second brin d'ADNc.

Coupure par les enzymes de restriction XhoI et SacI.

Clonage dans le vecteur Lambda Zap II.

Intérets des ADNc pleine longueur

La comparaison des séquences d'ADNc pleine longueur d'Arabidopsis thaliana (ou de n'importe quel organisme) avec les séquences génomiques (mais aussi les données d'EST) permet :

• d'obtenir des informations directes ou indirectes sur la structure d'un trés grand nombre de gènes :
  1. séquence codante complète
  2. régions non traduites en 5' et en 3' contenant des séquences d'éléments de régulation post-transcriptionnelle agissant en cis (action d'une molécule sur elle-même) et/ou contenant des motifs de fixation de facteurs agissant en trans.
  3. UTRdb : base de données de régions 5' et 3' non-traduites d'ARNm d'eucaryotes.
• d'améliorer l'annotation du génome.
• Voir un article

Autre intéret d'ADNc pleine longueur : il y a peu d'hybridation croisée ("cross-hybridization") avec des pseudogènes.

Applications des ADNc pleine longueur

• génomique fonctionnelle : profil d'expression / analyse des séquences de régulation de la transcription, de la traduction, des frontières intron - exons.
• études de transgènes / d'effets de suppression (antisens) / de RNAi.
• annotation des génomes.
• obtention de protéines recombinantes (sur-expression) en quantité suffisante pour étudier la fonction des protéines voire leur structure.

Source : "RIKEN - Full-length cDNAs"

3. Caractéristiques de la puce

• avec la plante non stressée
• après un traitement à l'ABA, au froid, à la dessication (déshydratation)
• et ce, à différents stades de développement (de la germination à la la graine mature)

contrôles positifs

ADNc issus des gènes rd et erd

gènes d'Arabidopsis thaliana inductibles par la dessication

contrôle interne

séquence d'ADN amplifiée par PCR

fragment d'ADN du phage lambda

contrôles négatifs

fragment d'ADN du gène d'un récepteur nicotinique de la souris (nAChRE)

fragment d'ADN du gène d'un homologue du recepteur de glucocorticoïde de souris

ADN sans aucune homologie avec une quelconque séquence d'Arabidopsis thaliana qui permet d'évaluer toute hybridation non spécifique.

L'intensité de chaque spot reflète le niveau d'expression de chaque gène.

• contrôle positif : le gène rd29A dont l'expression est induite par le froid donne un signal rouge.
• contrôle interne : le fragment d'ADN du phage lambda (ou de la tubuline dans l'exemple ci-contre) donne un signal jaune.
• contrôle négatif : aucun signal n'est détecté pour le gène de la souris nAChRE.

Source : Seki et al. (2001)

Ces témoins permettent le calcul des rapports d'intensité de fluorescence (IF) puis la valeur [(log2(r)] entre la condition normale (non stressée) et la condition de stress.

Par exemple, le rapport dans le cas de la dessication est calculé de la manière suivante :

Le marquage des cibles consiste en l'incorporation de nucléotides portant :

• soit le fluorophore cyanine 3 (Cy3™) sous forme de Cy3-dUTP
• soit le fluorophore cyanine 5 (Cy5™) sous forme de Cy5-dUTP

Ces 2 molécules sont les plus classiquement utilisées.

MMT : groupe 4-monomethoxytrityle

Source : Amersham Biosciences Limited

4. Vérification des données issues de la puce à ADN par Northern blot

Les gènes dont le rapport d'augmentation d'expression (par exemple : dessication / non stressé) est supérieur à 2 fois celui du contrôle positif sont réputés inductibles par le stress considéré.

La seule manière de confirmer ce genre de résultat est de faire un Northern blot à partir des ARNm correspondants aux ADNc candidats.

Parfois, les résultats ne concordent pas et les "faux-positifs" issus de la puce à ADN peuvent être dûs aux biais suivants :

• une faible expression des gènes considérés
• un bruit de fond élevé
• de la poussière sur le spot de la puce
• des cibles de mauvaise qualité

Ci-contre, comparaison des données issues de la puce à ADN et des résultats du Northern blot.

Conditions testées :

• témoin non stressé
• 2 temps de dessication et de froid (2h et 10h)
• gène induit par un stress et sous le contrôle du facteur de transcription 35S:DREB1A (promoteur CaMV 35S de plantes transgéniques)

Les rapports d'augmentation d'expression sont indiqués en dessous de chaque autoradiographie.

Voir N° accession GenBank : AB044404 - cold acclimation protein WCOR413

Source : Seki et al. (2001)

5. Résultats généraux

• Aller à la base de données "RIKEN"
• Choisir l'onglet "Download"
• Sélectionner "Seki et al. (2002) Plant J. 31:279-292"
• Cliquer sur "Files - Supplemental Data (zip compressed file: 235KB)"

Tableau I simplifié (Excel)

Tableau I simplifié (Zip)

Diagramme de John Venn (1834-1923)

Schémas géométriques utilisés pour représenter des relations logico-mathématiques.

Exemple : 245 gènes induits par l'ABA = 41 gènes + 71 gènes + 19 gènes + 114 gènes

stress

nombre de gènes dont l'expression augmente

nombre de gènes dont l'expression diminue

ABA

245 gènes

22 codent pour des facteurs de transcription : 1 de la famille DREB / 2 - famille ERF / 5 - famille doigt de zinc / 1 - famille WRKY / 3 - famille MYC/MYB / 1 - famille bHLH / 4 - famille NAC / 2 - famille homéodomaine / 2 - famille bZIP / 1 - autre famille

34

dessication

54

77

froid

299

70 (ou 79 ? - p. 290)

forte salinité

213

79 (ou 70 ? - p. 290)

Exemples de bases de données de facteurs de transcription spécifiques des plantes :

• PlantTFDB ("Plant Transcription Factor Database")
• DATF ("Database of Arabidopsis Transcription Factors")
• STIFDB ("Stress responsive TranscrIption Factor Database")

L'ABA est un messager capital de nombreuses voies de transduction du signal (figure ci-contre) en réponse à des stress biotiques et abiotiques.

Figure ci-contre, rôle de l'ABA dans la régulation de la transcription de gènes (activation de facteurs de transcription de type ABI).

Source : "ABA perception and signalling" Raghavendra et al. (2010) TIBS 15, 395 401

6. Exemple de résultats concernant un gène inductible par l'ABA - RAFL cDNAs : "RIKEN Arabidopsis Full-Length cDNAs"

Aller à : RIKEN Database

Choisir "Search Microarray Data" (fenêtre de gauche).

Taper "RAFL09-13-A04" être.

Item "Select the Experiment", cocher "ABA".

Tableau de résultats :

"Clone Name" : cliquer sur le lien "RAFL09-13-A04".

Cliquer sur le lien : "View Genome Map".

Locus TAIR : AT1G08920

Contig

ARNm : AF367260

Ontologie :

"biological process : involved in monosaccharide transport, response to abscisic acid stimulus, response to salt stress, response to water deprivation".

"cellular component : located in membrane, plant-type vacuole membrane".

"molecular function : has carbohydrate transporter activity" - accession : GO:0015144

L'ensemble correspond à la signature d'une protéine de transport du sucre, riche en hélices transmembranaires.

Accession : AAK56249

RIKEN

PLACE

Seki et al. (2001) "Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray" Plant Cell 13, 61 - 72

Raghavendra et al. (2010) "ABA perception and signalling" TIBS 15, 395 401

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