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Détermination des séquence en nucléotides par la méthode de Fréderick Sanger (Prix Nobel chimie 1980) |
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Détermination des séquence en nucléotides par la méthode de Fréderick Sanger (Prix Nobel chimie 1980) |
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Source : University of Michigan |
Le principe consiste à synthétiser toutes les copies partielles intermédiaires possibles de la molécule d'ADN. Cette synthèse est réalisée à l'aide d'un composé chimique fluorescent qui provoque l'interruption au hasard, mais systématique à la suite d'un seul des 4 nucléotides A, T, G ou C. Quatre réactions de séquençage sont menées en parallèle dans quatre tubes distincts, contenant chacun un nucléotide modifié : le didésoxyribonucléotide (ddTTP, ddATP, ddCTP et ddGTP) . Le didésoxyribonucléotide interrompt la polymérisation lorsqu'il sera intégré :
On fait donc, en parallèle, 4 séries de copies. Dans chaque série, toutes les copies sont interrompues derrière un seul type de nucléotide. Exemple ci-contre : toutes les copies intermédiaires d'une série sont terminées par un C. |
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On sépare alors les copies selon leur taille par une migration électrophorétique dans un gel poreux. Ces gels permettent de séparer deux intermédiaires consécutifs qui ont une différence de taille d'un seul nucléotide.
Source : University of Michigan |
Il devient possible de reconstituer la succession des nucléotides tout au long de la séquence.
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Le séquençage est une technique automatisée. Exemple : le séquenceur "MegaBACE®" (société Amersham) qui est une plateforme capillaire à haut débit pour l'analyse d'ADN en séquençage et en analyse de fragments (génotypage, SNP, ...)
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Voir le matériel
de la plate-forme de séquençage et de génotypage de
Roscoff (Génopole Ouest)
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A la suite du séquençage du génome humain, des projets de séquençage de l'ADN à grande échelle sont devenus plus communs. Un article publié dans l'édition en ligne de la revue Nature décrit une méthode 100 fois plus rapides que les pratiques conventionnelles. Cette nouvelle technique (conçue par J. Rothberg) utilise des puits minuscules en fibre optique et une barrette contient 1.6 millions puits. En utilisant la lumière pour mesurer les réactions, les essais de l'appareil indiquent qu'il est capable de séquencer 25 millions de bases en un seul passage de 4 heures avec plus de 99% d'exactitude.
Figure ci-contre, la ligne de production automatique pour la préparation des échantillons pour le séquençage du génome humain au Whitehead Institute - Center for Genome Research. Source : HGP - Nature 409, 860 - 921 |
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