Les acides aminés et la structure primaire des protéines

1. Structure générale et stéréochimie des acides aminés

2. Structure des chaînes latérales

3. Nature et caractéristiques des chaînes latérales

4. Propriétés physico-chimiques des acides aminés

5. La structure primaire ou séquence primaire ou enchaînement des acides aminés ou chaîne polypeptidique

a. La liaison peptidique

b. Détermination de la séquence primaire à partir de l'extrémité N-terminale : la dégradation de Pehr Edman

c. Détermination de la séquence primaire à partir de l'extrémité C-terminale : carboxypeptidase

d. Machine "artificielle" de synthèse peptidique

6. Acides aminés et protéines intrinsèquement désordonnées

7. Expériences pour l'étude de la structure primaire de l'hirudine

8. Liens Internet et références bibliographiques

A l'exception de la glycine (Gly), tous les acides aminés possèdent un carbone α asymétrique (ou chiral).

Il existe donc pour chacun d'entre eux deux isomères stéréochimiques, images en miroir, appelés énantiomères (figure ci-contre).

La convention pour définir la stéréochimie du carbone a s'appuie sur celle des énantiomères du glycéraldehyde.

A quelques rares exceptions près, les acides aminés constitutifs des protéines sont tous de configuration L.

Dans la cellule (pH neutre), le groupe α-carboxyle et le groupe α-aminé sont ionisés :

• pK_a groupe carboxyle : 1,8 à 2,5
• pK_a groupe aminé : 8,7 à 10,7

Les acides aminés sont des ions amphotères (ou zwiterrions).

2. Structures des chaînes latérales

La figure ci-dessous montre les chaines latérales des 20 acides aminés les plus fréquemment utilisés pour la synthèse des protéines.

Le nom de l'acide aminé selon le code à trois lettres est écrit entre parenthèses.

2 cas particuliers :

• Glycine (Gly) : seul acide aminé non chiral et le plus petit
• Proline : acide α-Iminé (groupe aminé secondaire). Sa chaîne latérale liée à la fois au groupe α-carboxyle et au groupe α-aminé.

code

aliphatique (hydrocarbure saturé)

Ala : groupe méthyle

Val, Leu & Ile : chaîne ramifiée

V

acide α-Iminé (groupe aminé secondaire)

chaîne latérale liée à la fois

au groupe α-carboxyle ET au groupe α-aminé

structure particulière qui impose des changements de direction de l'enchaînement des carbones α des chaines polypeptidiques

groupe aromatique

Phe : groupe phényl

Trp : noyau indole

absorbent la lumière UV (ce qui permet de mesurer la concentration d'une protéine en solution)

Phe : λ = 260 nm / Trp : λ = 278 nm

Tyr à pH 7 : λ = 273 - 277 nm

Tyr à pH 13 (ion phénolate) : λ = 293 - 297 nm

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules)

trés polaires

souvent à la surface des protéines (liaisons hydrogène)

alcool aliphatique

groupe β - hydroxyle

bases azotées

Lys : groupe ε - aminé

Arg : ion guanidinium

His : noyau imidazole

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules

réactif au sein des protéines, exemple : protéases à sérine

(catalyse acide base)

Cas particuliers : Asx = Asp ou Asn - B (voir "Hydrolyse totale de protéines") / Glx = Glu ou Gln - Z / N'importe quel acide aminé = Xaa - X

Outre les 20 acides aminés les plus fréquemment utilisés pour la synthèse des protéines, 319 autres acides aminés ont été recencés dans les protéines.

En voici quelques exemples :

4. Propriétés physico-chimiques des acides aminés

Les acides aminés ont des propriétés physico-chimiques trés diverses. La base de données " ProtScale" fournit près de 60 tables de valeurs de ces propriétés.

En voici quelques exemples : (Source : " ProtScale")

• la composition en acides aminés (pourcentage de fréquence - "A.A. composition") sur la base de l'ensemble des protéines de la base de données "Swiss-Prot"
• le poids moléculaire ("molecular weight")
• l'hydrophobicité (échelle de Kyte & Doolittle - échelle de Joel Janin, ...)
• la propension à être intégré dans une hélice α ("alpha-helix") ou dans un feuillet β ("beta-sheet") (échelle de Chou & Fasman - échelle de Levitt, ...)
• la mutabilité relative ("relative mutability")

5. La structure primaire ou séquence primaire ou enchaînement des acides aminés ou chaîne polypeptidique

a. La liaison peptidique

Les protéines sont des bioplolymères formés par la condensation des acides aminés.

La liaison qui unit 2 acides aminés consécutifs s'appelle la liaison peptidique.

La liaison du carbone carbonyle avec l'azote dans la liaison peptidique (1,33 Å, non indiquée dans la figure) est plus courte que la liaison simple C-N mais plus longue qu'une liaison double C=N classique.

Le caractère partiellement double de la liaison peptidique empêche la rotation autour de la liaison C-N.

En conséquence, le groupe peptidique est confiné dans un plan.

Il existe cependant une liberté de rotation autour des liaisons Cα-C et N-Cα.

On obtient ainsi un enchaînement d'acides aminés. C'est ce que l'on appelle la structure primaire ou séquence ou chaîne polypeptidique.

La chaîne polypeptidique est toujours représentée depuis l'extrémité N-terminale (c'est-à-dire l'acide aminé qui a un groupe α-aminé libre) jusqu'à l'extrémité C-terminale (l'acide aminé qui a un groupe α-carboxyle libre).

La fonction α-aminée de l'acide aminé en position N-terminale de la chaîne polypeptidique d'une protéine (ou d'un polypeptide) est traitée à pH alcalin par l'isothiocyanate de phényle (PITC), appelé aussi réactif d'Edman.

On obtient un dérivé phénylthiocarbamyle (PTC) de la protéine ou du peptide. Ce dérivé est traité par un acide anhydre tel que l'acide trifluoroacétique.

Source figures : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994), Ed. DeBoeck Universités

La liaison peptidique liant l'acide aminé en position N-terminale est spécifiquement coupée. Le dérivé anilinothiazolinone de cet acide aminé est séparé du reste de la chaîne polypeptidique par extraction avec un solvant organique, le chlorure de butyle.

On traite ce dérivé instable par une solution acide qui le transforme en dérivé stable : le phénylthiohydantoïne acide aminé (PTH - acide aminé).

Le PTH - acide aminé est séparé, quantifié et identifié par chromatographie en phase reverse avec une phase stationnaire sur laquelle est greffée une chaîne alkylée en C18 (octadécyl) ;

Le reste de la chaîne polypeptidique subit de nouveau l'ensemble du traitement et les acides aminés sont ainsi séquencés tour à tour à partir de l'extrémité N-terminale.

La séquence en position C-terminale d'une protéine est obtenue par action de la carboxypeptidase Y :

• on prélève une fraction aliquote du milieu réactionnel à différents temps d'action de l'enzyme

• l'échantillon est traité par le PITC

• on sépare le PTH - acide aminé libéré par l'action de l'enzyme par chromatographie en phase reverse

• on trace la cinétique de libération des acides aminés (figure ci-contre)

La vitesse de libération des acides aminés permet d'établir la séquence primaire.

Dans le cas présent :

Gln - Leu - Tyr - Glu - Glu

d. Machine "artificielle" de synthèse peptidique

Les ribosomes synthétisent les protéines en polymérisant (liaison peptidique) les acides aminés dans un ordre déterminé par les ARN messagers.

Des chercheurs ont créé une "machine artificielle de synthèse peptidique" : elle se déplace le long d'un chapelet de molécules, ramasse les acides aminés qui bloquent sa trajectoire, afin de synthétiser un peptide selon une séquence spécifique.

La structure chimique est basée sur un rotaxane, un anneau moléculaire enfilé sur un axe moléculaire.

L'anneau porte un groupe thiolate qui enlève de manière itérative les acides aminés dans l'ordre codé par le brin et les transfère vers un site l'élongation du peptide par ligature chimique.

Source : Lewandowski et al. (2013)

La synthèse est obtenue avec 10¹⁸ "machines moléculaires" agissant en parallèle. Le processus génère des quantités de peptide de l'ordre du milligramme avec une séquence unique confirmée par spectrométrie de masse.

6. Acides aminés et protéines intrinsèquement désordonnées

Les protéines ou régions intrinsèquement désordonnées ou "intrinsically disordered proteins or regions" - IDP/IDR :

• peuvent se replier ou s'enrichir en structures secondaires lorsqu'elles interagissent avec leur(s) cible(s) biologique(s).
• sont désordonnées sur une grande partie de la chaîne polypeptidique ou contiennent des régions désordonnées (en nombre variable).
• sont caractérisées par une faible complexité de séquence, un biais dans leur composition en acides aminés et une forte flexibilité prédite.

Les IDP établissent moins de liaisons intramoléculaires stabilisatrices et sont donc plus dynamiques que les protéines ordonnées. En effet, elles ne possèdent pas suffisamment d'acides aminés non polaires pour former le coeur hydrophobe caractéristique des protéines ordonnées.

Cependant, beaucoup d'IDP sont partiellement repliées et ont donc une compacité moyenne (ramenée à la longueur de la chaîne polypeptidique) supérieure à celle d'une chaîne polypeptidique complétement dénaturée / dépliée ("random coil").

On a recensé envron 460 propriétés physico-chimiques pour les acides aminés. Bon nombre d'entre elles sont "redondantes" ou en tout cas, il existe une forte corrélation entre elles.

La charge nette d'une protéine est la propriété physico-chimique qui semble la plus discriminante pour déterminer son degré de désordre et donc s'il s'agit d'une IDP. Cela semble logique puisque plus la charge nette d'une protéine est importante plus les forces de répulsion électrosatiques le sont et plus la chaîne polypeptidique a tendance à être dépliée / désordonnée.

Les études statistiques et bioinformatiques de trés grands jeux de données d'IDP (dis XRAY, dis NMR, dis CD, dis Fam32) ont permis de classer les acides aminés du "plus promoteur d'ordre" au "plus promoteur de désordre" : W, F, Y, I, M, L, V, N, C, T, A, G, R, D, H, Q, K, S, E, P

Propriétés physico-chimiques les plus discriminantes

Source : Dunker et al. (2001)

Kyte & Doolittle (1982) "Amino acid scale: Hydropathicity" J. Mol. Biol. 157, 105 - 132

Eisenberg et al. (1984) "Amino acid scale: Normalized consensus hydrophobicity scale" J. Mol. Biol. 179, 125 - 142

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Bases de données qui recense les échelles de valeurs des propriétés physico-chimiques des acides aminés :

• Expasy - ProtScale
• AAindex : "Amino acid indices, substitution matrices and pair-wise contact potentials"

La composition en acides aminés de 4 jeux de données "protéines désordonnées" (dis XRAY, dis NMR, dis CD, dis Fam32) ont été comparés entre eux et avec un jeu de données "protéines ordonnées".

La proportion de chaque acide aminé dans chacun des jeux de données a été exprimée par : [nombre de l'acide aminé considéré dans les protéines désordonnées) - (nombre de l'acide aminé considéré dans les protéines ordonnées)] / (nombre de l'acide aminé considéré dans les protéines ordonnées).

Dans la figure ci-contre, un pic négatif signifie donc que le jeux de données "protéines désordonnées" considéré contient moins l'acide aminé considéré que le jeu de données "protéines ordonnées".

Source : Dunker et al. (2001)

Les acides aminés sont rangés en fonction de leur indice de fléxibilité corrigé par le facteur de température ("Debye-Waller factor" ou "B-factor") qui tient compte des mouvements dûs à la châleur sur l'atténuation de la diffraction des rayons X. Celà permet de tenir davantage compte de certains effets de l'environnement sur les acides aminés.

L'acide aminé le moins flexible est à gauche (Trp) et le plus flexible est à droite (Lys).

Si on représente la valeur absolue de la charge nette moyenne (c'est-à-dire pondérée par la longueur de la chaîne polypeptidique de l'IDP considérée) à pH 7 (<R>) en fonction de la valeur absolue de l'hydrophobicité moyenne (<H>), on obtient un graphique avec deux zones qui correspondent aux IDP et aux protéines structurées, respectivement.

Ces zones sont délimitées par une droite d'équation : <H> = [ <R> + 1,151 ] / 2,785 et les IDP sont au dessus de cette ligne.

On obtient un graphique équivalent si on représente <R> en fonction de la valeur absolue de l'hydropathie moyenne ("GRand Average of hYdropathy" - <GRAVY>).

Source : Uversky et al. (2000)

RESID Database

PIR

Bases de données sur les propriétés physico-chimiques des acides aminés (sous-partie de la base de données "Expasy - Swiss-Prot")

ProtScale

Swiss-Prot

PROWL

Dunker et al. (2001) "Intrinsically disordered protein" J. Mol. Graph. Model 19, 26 - 59

Uversky et al. (2000) "Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions ?" Proteins 41, 415 - 427

Article

Article

Jaspard et al. (2012) "Computational and Statistical Analyses of Amino Acid Usage and Physico-Chemical Properties of the Twelve Late Embryogenesis Abundant Protein Classes" PLoS ONE 7, e36968

Lewandowski et al. (2013) "Sequence-Specific Peptide Synthesis by an Artificial Small-Molecule Machine" Science 339, 189 - 193

Article

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