1. Introduction.

2. Les principaux types de récepteurs

a. Les récepteurs membranaires métabotropes

b. Les récepteurs membranaires ionotropes

c. Les récepteurs nucléaires

3. Les récepteurs couplés aux protéines G (récepteurs membranaires métabotropes)

a. Généralités

b. Les principales classes (ou familles) de récepteurs couplés aux protéines G

c. RCPG : aide à la classification et à l'organisation des protéines via leur spécificité de fixation de ligand

d. Traffic intracellulaire et recyclage des RCPG

e. Voie non conventionnelle de la signalisation par les RCPG : "2ème vague" d'activation via les endosomes

f. Application bioinformatique

4. Les protéines G

5. Exemples de transduction de signaux par des récepteurs couplés aux protéines G

6. Le récepteur de l'insuline

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

Toutes les cellules ont mis au point des mécanismes qui leur permettent de percevoir des signaux internes ou provenant de leur environnement et d'y apporter une réponse appropriée.

Si les signaux sont extracellulaires, il existe des systèmes de transduction des signaux qui modifie leur nature de sorte que leur sens biologique soit "compris" à l'intérieur de la cellule.

Cela implique l'existence de protéines particulières au niveau des membranes : les récepteurs.

Pour survivre, les organismes unicellulaires doivent trouver et ingérer leur nourriture tout en évitant les substances toxiques. Les organismes supérieurs doivent répondre à une série de signaux encore plus importante et définir des systèmes de réponse pour :

• les éléments nutritfs
• les facteurs de croissance
• les neurotransmetteurs
• les stimuli sensoriels

Exemples de stimuli capables d'activer un récepteur couplé aux protéines G - RCPG (Source : J.M. Botto)

• Acide glutamique, acide γ-aminobutyrique
• Amines : acétylcholine , adrénaline , noradrénaline , dopamine , histamine, mélatonine, sérotonine, ...
• Nucléotides/side : ATP, ADP, UTP /adénosine, UDP-glucose, ...
• Lipides : anandamide, 2-arachidonoyl-glycérol, leucotriènes, prostaglandines, thromboxane A2, ...
• Peptides endogènes : mélanotropines (α, β et γ), β-endorphine, Met-enképhaline, amyline, angiotensine II, bradykinine, kallidine, ...
• Photons : rhodopsine des cellules en bâtonnets, opsines rouge, verte et bleue des cônes
• Ions Ca2+
• Composés du système immunitaire : chimiokines, anaphylatoxines C3a et C5a du complément, peptides N-formylés chimiotactiques
• Protéines :
  1. hormones glycoprotéiques (follitropine - FSH, choriogonadotropine - HCG, lutropine - LH, thyrotropine - TSH)
  2. thrombine (protéase)
  3. latrotoxine (toxine)
  4. molécules d'adhésion (CD55)
• Les RCPG pour lesquels on n'a pas identifié le(s) ligand(s) sont dits "orphelins ("orphan receptors"). Depuis 2002, la recherche intensive de ces ligands a permis d'identifier des métabolites impliqués dans le métabolisme énergétique : lactate, succinate, chaîne d'acide gras libre, acides biliaires, ...

Dans tous ces cas :

• le signal initial doit être reçu par la cellule concernée
• il doit être transmis au travers de la membrane plasmique
• dans certains cas il doit être aussi transmis au travers de la membrane nucléaire

La transduction des signaux se traduit par une série ou cascade de modifications des structures des molécules impliquées dans cette signalisation. Ces évènements ont une incidence sur d'autres processus biologiques ou voies métaboliques.

La transduction du signal est extrêmement régulée.

Exemple d'une cascade d'évènements

L'activation des récepteurs couplés aux protéines G entraîne une cascade d'événements (figure ci-contre) telle que :

• l'activation d'un récepteur par son ligand

• l'activation d'une protéine G par hydrolyse du GTP

• l'activation ou l'inhibition d'une protéine effectrice par une protéine G

Cette cascade d'événements inclut trés souvent la modulation de la concentration intracellulaire de molécules intermédiaires appelées messagers secondaires.

Exemples :

• l'AMP cyclique synthétisé par l'adénylate cyclase. L'AMP cyclique , active à son tour la protéine-kinase A.

• la synthèse de phosphoinositol qui se lie à un récepteur du réticulum endoplasmique, ce qui provoque la libération de calcium.

• la synthèse de diacylglycérol qui active la protéine kinase C.

• l'augmentation de la concentration du calcium intracellulaire libre ou sous forme liée à la calmoduline (CaM). La CaM liée au calcium active les CaM-kinases qui phosphorylent de nombreuses protéines

2. Les principaux types de récepteurs

A. Les récepteurs membranaires

a. Les récepteurs métabotropes

Ce sont des protéines membranaires qui, après avoir fixé un ligand, changent de conformation et activent une cascade d'événements intracellulaires.

Des récepteurs métabotropes ont été identifiés chez les animaux et les plantes.

Il en existe plusieurs classes :

• les récepteurs couplés à des protéines G (RCPG) trimériques

• les récepteurs couplés à une enzyme intrinsèque qui, après avoir fixé leur(s) ligand(s), propagent le signal grâce à l'activité enzymatique de leur domaine intra-cellulaire.

Il existe 3 grands types de récepteurs couplés à une enzyme intrinsèque :

• les récepteurs à activité guanylyl cyclase (synthèse de GMP cyclique). Exemples : récepteurs des peptides natriurétiques, récepteurs cytosoliques au monoxyde d'azote (NO)
• les récepteurs à activité tyrosine kinase, par exemple, le récepteur de l'insuline
• les récepteurs à activité tyrosine phosphatase c

b. Les récepteurs ionotropes

Ce sont des protéines membranaires qui, après avoir fixé un messager chimique, ouvrent un canal ionique. Il sont généralement caractéristiques d'un ion (Na+, K+, Ca2+, Cl-).

Il existe plusieurs classes de récepteurs ionotropes :

a. Les récepteurs trimériques activés par l'ATP (récepteurs purinergiques)

L'ATP est un intermédiaire dans la communication cellulaire (exemple : la transmission synaptique entre neurone)s. C'est un nucléotide qui peut être relargué en grandes quantités par des cellules en stress (inflammation, trauma, hypoxie). Dans ce cas, L’ATP est un signal de danger qui indique au système immunitaire que des tissus sont détruits.

L’ATP extracellulaire est reconnu par des récepteurs purinergiques dont il existe 2 types :

• les récepteurs P2Y à 7 hélices transmembranaires, couplés à des protéines G hétérotrimériques

• les récepteurs P2X : protéines transmembranaires qui forment des canaux ioniques

Les récepteurs - canaux ioniques P2X contrôlent de manière non-sélective le passage de cations (Na⁺, K⁺ et Ca²⁺) au travers de la membrane plasmique de la cellule.

La fixation réversible de l'ATP sur le récepteur induit un changement de conformation du récepteur : ce canal ionique trans-membranaire est alors ouvert ce qui entraîne un influx de [Ca²⁺ / Na⁺] et un efflux de K⁺.

Les récepteurs ATP2X sont structurés en 3 sous-unités homologues.

Chaque sous-unité contient un domaine amino terminal extra-cellulaire, suivi par 2 segments transmembranaires séparés par un domaine extra-cellulaire.

Source : Jiang et al. (2011)

b. Les récepteurs tetramériques activés par le glutamate

Ils sont spécifiques des cations.

Ils sont structurés en 4 sous-unités homologues. Chaque sous-unité contient :

• un domaine amino terminal extra-cellulaire comparable au domaine de fixation [Leu / Ile / Val] bactérien ("LIVBP")
• suivi par une moitié du domaine de fixation du ligand
• puis 2 segments transmembranaires séparés par une boucle dite "P-loop"
• la seconde moitié du domaine de fixation du ligand
• et enfin un 3ème segment transmembranaire

Exemple : le récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA)

c. Les récepteurs pentamériques ou "Cys-loop"

Ce type de récepteurs constitue une superfamille.

Ils sont structurés en 5 sous-unités homologues.

Exemple : le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (figure ci-contre).

Chaque sous-unité contient :

• un domaine amino terminal extra-cellulaire
• 4 segments transmembranaires (M1 à M4)
• la boucle localisée entre M3 and M4 constitue le domaine intracellulaire, de taille variable

Source : Karlin A. (2002)

Les récepteurs pentamériques ou "Cys-loop" peuvent être :

• des canaux cationiques (exemples : le récepteur nicotonique, le récepteur 5-HT3)
• des canaux anioniques (exemples : le récepteur GABA, le récepteur glycine)

Figure ci-contre : représentation de la structure quaternaire du récepteur nicotinique de l'acétylcholine dans laquelle on voit :

• la position spatiale des 5 sous-unités
• "ACh" : les 2 sites de fixation de l' acétylcholine (entre les sous-unités α et γ, et entre les sous-unités α et δ)
• le canal cationique au sodium

Source : Karlin A. (2002)

Aller à la base de données "Ligand-Gated Ion Channels Database" - EBI

Aller à la base de données "Orientation of Proteins in Membranes - OPM"

Voir la définition de protéines monotopiques (interaction avec une face de la membrane)

B. Les récepteurs nucléaires

a. Rôle

Ce sont des protéines actives dans le noyau qui relaient des signaux hormonaux qui modulent l'expression des gènes.

Il en existe plus de 150 repertoriés, dont plus de 50 chez l'homme.

Un grand nombre de ces récepteurs ont avant tout un rôle de facteurs de transcription. Pour certains, leur activité est induite par un ligand (hormones stéroïdes dérivées du cholestérol, lipides intracellulaires, vitamine D ...), d'autres n'ont pas de ligand identifié.

Ces récepteurs agissent en trans : ils induisent l'expression de gènes codant des protéines qui à leur tour activent de nombreux autres gènes.

Exemples de récepteurs nuléaires : récepteurs aux androgènes, aux oestrogènes, aux glucocorticoïdes, à la progestérone, aux hormones thyroïdiennes.

Certains récepteurs nuléaires ont un autre rôle et agissent sur d'autres voies de signalisation intracellulaire.

Base de données des récepteurs nucléaires : "NURSA" - The Nuclear Receptor Signaling Atlas

b. Structure des récepteurs nucléaires

Ils ont une structure globale conservée.

Ils sont constitués de 2 domaines :

• un domaine de liaison à l'ADN ("DNA Binding Domain"- DBD) sur des séquences d'ADN particulières qui se trouvent à proximité des gènes qu'ils régulent. Ces séquences sont appelées éléments de réponse à l'hormone ("Hormone Responsive Element" - HRE).

• un domaine de liaison au ligand ("Ligand Binding Domain" - LBD).

La région N-terminale (domaine A / B) est la plus variable en ce qui concerne la taille et la séquence en acides aminés.

Il existe une forte homologie de séquence au sein des domaines DBD et LBD , respectivement.

Les domaines AF1 et AF2 sont impliqués dans l'activation de la transcription.

Source : "Activation des récepteurs nucléaires"

Une fois activés, ces récepteurs se fixent sur l'ADN sous forme d'homo- ou d'hétérodimères. Les récepteurs nucléaires peuvent être classés en 4 groupes en fonction du type de dimérisation et des séquences d'ADN reconnues. Les acides aminés impliqués dans la dimérisation des récepteurs pour leur activité transcriptionnelle, se trouvent dans les domaines C et [E / F].

La séquence en acides aminés appelée signal de localisation nucléaire ("Nuclear Localisation Signal" - NLS) permet au récepteur d'être adressé au noyau et d'y rester.

Figure ci-contre : structure cristalline (résolution 2.9 Å) des multiples domaines de HNF-4α humain (sous forme d'homodimère) fixé à son élément de réponse et à des peptides co-activateurs.

Une arginine cible de la méthylation par PRMT1 et une serine cible de la protéine kinase C contribuent au maintien des interactions entre domaines.

Ces modification post-traductionnelles induisent un changement de la fixation de l'ADN.

Source : Chandra et al. (2013)

Le récepteur "Hepatocyte Nuclear Factor 4α" (HNF-4α ou NR2A1) est un récepteur nucléaire - facteur de transcription.

HNF-4α est la protéine se fixant à l'ADN la plus abondante dans le foie où environ 40% des gènes transcrits possèdent un élément de réponse à HNF-4α.

Ces gènes sont impliqués en grande partie dans la néoglucogénèse et le métabolisme des lipides. Les mutations de HNF-4α sont donc liées à l'hypoglycèmie hyperinsulinèmique et au diabète de type 1.

c. Mode d'activation des récepteurs nucléaires

Tant que le récepteur n'a pas fixé le ligand, il est dans une conformation inactive car le domaine DBD est bloquée par un complexe protéique inhibiteur.

Quand le domaine LBD a fixé le ligand, il change de conformation et l'inhibiteur est relargué.

Le domaine DBD est libre et il se fixe sur la séquence d'ADN spécifique HRE, ce qu induit l'activation de la trancription des gènes.

Les domaines DBD sont des séquences d'environ 66 à 68 acides aminés, dont 9 cystéines conservées, qui adoptent une structure dite "en doigt de zinc" de type C4 (4 cystéines).

Cette structure est très rigide, et impose une topologie spécifique aux domaines DBD, qui permet à une hélice α de se positionner dans le grand sillon de l'ADN.

Figure ci-contre : les acides aminés de la "P-box" (cercles noirs) détermine la spécificité de reconnaissance de la séquence d'ADN.

Les acides aminés entourés d'un carré sont impliqués dans la dimérisation du récepteur.

Exemples de familles de facteurs de transcription

Famille bZIP ("basic leucine zipper") : leur nom vient du fait qu'ils contiennent un domaine de fixation à l'ADN mixte constitué d' une séquence en acides aminés basiques et d'un motif riche en leucine à intervalles réguliers ("leucine zipper").

Les facteurs de transcription GBF1, GBF2 et GBF3 ("Arabidopsis bZlP family of G-box binding factors") intéragissent avec le motif palindrome "G-box" (CCACGTGG) trouvés dans de nombreux promoteurs de plantes.

Famille HSF : ("heat shock transcription factor") : ils sont trimériques avec un domaine de fixation à l'ADN qui reconnaît la séquence répétée (nGAAn) et un domaine impliqué dans l'oligomérisation. Ils sont impliqués dans la réponse dite "de choc thermique" et la synthèse d'HSP ("heat shock proteins"). Il existe 3 classes (A, B et C).

Ces facteurs de transcription sont organisés en modules fonctionnels comme le facteur de transcription AtHsfA2 de Arabidopsis :

• le domaine N-terminal de fixation à l'ADN, caracterisé par un motif hélice-coude-hélice, qui se fixe au "heat stress elements" (HSE) du promoteur des gènes de réponse Hsf.
• un domaine qui contient des séquences répétées d'acides aminés hydrophobes (HR-A/B) impliqué dans l'oligomérisation du facteur de transcription
• un groupe d'acides aminés basiques (NLS) nécessaires à la localisation dans le noyau via l'interaction avec l'importine
• une région riche en leucine à l'extrémité C-terminale (NES) qui agit comme signal d'exportation vers le noyau via l'interaction avec l'exportine
• de courts motifs riches en acides aminés hydrophobes et volumineux eux-même dans un environnement de caractère acide (AHA1 et AHA2) forment le domaine essentiel à l'activité transcriptionnelle des facteurs de transcription de la classe A en recrutant les composants de la machinerie de l'ARN polymérase II

Famille WRKY : ils sont ainsi nommés parce qu'ils possèdent un domaine de fixation à l'ADN (du côté N-terminal) qui contient, une ou deux fois, la séquence en acides aminés (quasi invariante) WRKY.

Ils sont classés en fonction du nombre de motif WRKY et de leur motif "zinc-finger-like" : Cx[4,5]Cx[22,23]HxH ou Cx7Cx23HxC.

3. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

a. Généralités

Robert Lefkowitz et Brian Kobilka ont reçu le prix Nobel de Chimie en 2012 pour leurs travaux sur les RCPG.

Il existe plus de 1000 RCPG.

Les séquences codantes de leur gènes représentent plus de 1% du génome : à cejour près de 800 gènes identifiés chez l'homme ! (voir Fredriksson et al., 2003)

La structure de la grande majorité des RCPG est caractérisée par :

• l'extrémité N-terminale extracellulaire qui peut subir des modifications post-traductionnelles de type N-glycosylation.

• 7 hélices α trans-membranaires (TM1 à TM7) reliés par 3 boucles intracellulaires (I1, I2, I3) et 3 boucles extracellulaires (El, E2, E3).

• un pont disulfure entre les boucles El et E2.

• l'extrémité C-terminale intracellulaire qui possède parfois des sites d'ancrage lipidique dans la membrane (création d'une 4ème boucle, I4) : ces sites d'ancrage résultent d'une modification réversible de cystéines par palmitoylation. Le palmitate interagit avec une molécule de cholestérol (C) (Zheng et al., 2012).

• l'extrémité C-terminale intracellulaire qui peut-être phosphorylée (PP) sur différents résidus par la protéine kinase A, la protéine kinase C ou les GRK ("G-protein-coupled receptor kinases").

Source : "Récepteurs couplés aux protéines G"

Source : Venkatakrishnan et al. (2013)

b. Les principales classes (ou familles) de récepteurs couplés aux protéines G

Selon les nomenclatures, on parle de classes ou de familles de RCPG.

Il n'y a pas d'homologie entre les séquences en acides aminés des RCPG de ces 3 classes.

Classe A ("Rhodopsin like receptor family"). Ce sont de loin les plus nombreux : à ce jour plus de 660 gènes identifiés chez l'homme.

Voir une analyse des relation phylogénétiques des sous-classes A (Pelé et al., 2011)

Classe A / sous-type 1

Classe A / sous-type 2

Classe A / sous-type 3

Source : S. Martin

Source : P. Sarret

Comparaison de la profondeur des poches de fixation des ligands des RCPG de la classe A.

L'hélice transmembranaire TM4 est utilisée comme référence.

Source : Venkatakrishnan et al. (2013)

La profondeur de pénétration du ligand est :

• la plus grande pour la doxépine pour le récepteur de l'histamine H₁
• la moins grande pour la caféine pour le récepteur A_2AR

Les étiquettes au dessus des structures indiquent la sous-classe des RCPG de la classe A.

RCPG "orphelins" - Couples [RCPG - métabolites]

Au début des années 2000, on a découvert que des métabolites du métabolisme énergétique sont les ligands de certains RCPG (interaction de faible affinité - RCPG35, 40, 41, 43, 84, 91, 99, 120, ... chez l'homme) :

• lactate, succinate, β-hydroxybutyrate
• acide kynurénique (acide lysophosphatidique)
• acide 3-hydroxy-octanoique
• courtes, moyennes et longues chaînes d'acide gras libre
• acides biliaires

Ces récepteurs agissent comme des senseurs de l'activité métabolique ou du niveau énergétique de certains métabolites et utilisent cette information pour ajuster la sécretion d'hormones ou pour réguler l'activité métabolique de certaines cellules.

Voir une revue : Smith, NJ., 2012.

c. RCPG : aide à la classification et à l'organisation des protéines via leur spécificité de fixation de ligand

Il existe de nombreux exemples de protéines ayant des similitudes structurales qui fixent des ligands différents et qui ont donc des fonctions différentes. A l'inverse, il existe de nombreux exemples de protéines ayant des similitudes fonctionnelles avec des structures différentes.

Le nombre croissant de RCPG de différentes classes identifiés et de leur(s) ligand(s) permet, non pas de comparer les séquences protéiques, mais l'ensemble des ligands connus pour se fixer à un type de RCPG. La classification des protéines via leur similitude de liaison à un ou des ligand(s) est une approche alternative aux méthodes évolutives pour mieux comprendre la fonction des protéines et la transduction des signaux.

La comparaison du dendrogramme basé sur la similarité des ligands à celui basé sur la similarité des séquences de RCPG de la classe A (figure de gauche ci-dessous), a permis d'identifier des RCPG éloignés du point de vue de leurs séquences mais qui ont des similitudes de spécificité de ligand.

Ce genre d'approche a des applications dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques et la mise au point de nouveaux médicaments.

Source : Lin et al. (2013)

Source : GPCR network

d. Traffic intracellulaire et recyclage des RCPG

La phosphorylation de résidus Ser ou Thr de l'extrémité C-terminale par les GRK, joue un rôle capital dans le traffic intracellulaire et le recyclage des RCPG.

1ère étape : cette phosphorylation augmente la fixation de protéines appelées β-arrestines sur la surface intracellulaire du récepteur.

En masquant cette surface ("scaffolding proteins"), les β-arrestines empêchent ainsi le couplage du RCPG avec sa protéine G partenaire.

C'est la désensibilisation ("desensitization") du RCPG.

Source : Gurevitch & Gurevitch (2006)

2ème étape : les β-arrestines fixent le RCPG aux éléments de la machinerie d'internalisation, la clathrine et l'adaptateur de la clathrine AP2 ("coated pit"). Il y a endocytose du RCPG (endosomes).

3ème étape : le RCPG est alors

• soit dirigé vers les lysosomes pour y être dégradé (c'est le cas en général d'un complexe [RCPG / β-arrestine] fort).

• soit recyclé vers la membrane plasmique (resensibilisation - "resensitization") où il est de nouveau apte à percevoir le signal (cas d'un complexe [RCPG / β-arrestine] faible).

e. Voie non conventionnelle de la signalisation par les RCPG : "2ème vague" d'activation via les endosomes

La voie classique ou principale de la transduction du signal médié par les RCPG est celle qui met en jeu les RCPG liés à la membrane plasmique.

La difficulté majeure pour étayer la ou les voie(s) moins conventionnelle(s), après internalisation de RCPG dans des endosomes, est l'absence de méthodes d'analyse qui fournissent des preuves expérimentales à l'échelle sub-cellulaire.

En d'autres termes, il est difficile de prouver que les RCPG localisés dans les endosomes sont encore actifs.

Source : Irannejad et al. (2013)

Une preuve expérimentale qui renforce cette hypothèse a récemment été apportée par l'utilisation de nano-anticorps ("nanobodies" - "conformation-specific single-domain antibodies"), qui sont les plus petits fragments d'anticorps entièrement fonctionnels, naturellement produits chez le chameau.

Du fait de leur petite taille (15 kDa) et de leur flexibilité, ils accèdent à des régions de protéines que les anticorps ne peuvent pas atteindre. Ils ont notamment été employés pour stabiliser les formes actives des couples [RCPG - protéine G] afin de les cristalliser (Steyaert & Kobilka, 2011) .

Cette technique a été employée pour sonder directement l'activation du récepteur β₂-adrénergique (β₂AR) associé à une protéine G de la classe G_s qui stimulent la production de l'AMPc dans des cellules de mammifère.

2 nano-anticorps ont été utilisés : Nb80 qui se fixe à β₂AR et Nb37 qui se fixe à la forme G_s dépourvue du nucléotide.

Modèle décrivant 2 phases d'activation de [β₂AR - G_s]

1ère phase : au niveau de la membrane plasmique qui résulte en un premier accroissement du taux d'AMPc.

il y aurait ensuite formation d'invaginations (recouvertes de clathrine) de la membrane : interaction du récepteur avec la β-arrestine, activation d'enzyme ERK et autres signaux non conventionnels.

2ème phase : après internalisation du récepteur dans les vésicules sous forme d'endosomes. C'est la "2ème vague" impliquant la protéine G_s, qui résulte en un second accroissement du taux d'AMPc.

Source : Lohse & Calebiro (2013)

L'agoniste adrénergique isoprénaline active le récepteur et la protéine G dans la membrane plasmique, comme prévu, mais aussi dans la membrane de l'endosome précoce.

Les récepteurs internalisés dans des endosomes contribuent à la réponse AMPc globale quelques minutes après application de l'agoniste.

f. Application bioinformatique

Aller à la base de données dédiée aux RCPG : "GPCRDB : Information system for G protein-coupled receptors"

"Search" => Fenêtre "Protein search" => champs "Description" => taper "serotonin".

Exercice d'alignement de séquences de la famille des récepteurs de la sérotonine de type 1a :

• Cliquer sur le lien "Serotonin type 1a"

• Cliquer sur le lien "Alignments & Analyses", puis "Download alignments (fasta)". Copier quelques séquences au format FASTA.

• Lancer le logiciel d'alignement "Multalin".

• Coller les séquences et lancer le programme.

Tirer des conclusions quant à la nature des acides aminés conservés.

Remarque :

• l'onglet "MView alignment" permet de visualiser directement des alignements.
• l'onglet "JalView multiple sequence alignment" nécessite l'activation de Java dans le navigateur.

4. Les protéines G

Elles ont été découvertes par Alfred G. Gilman et Martin Rodbell (prix Nobel de médecine 1994).

Les protéines G (G pour "Guanine nucleotide binding proteins") participent à la transduction du signal : ce sont des intermédiaires entre les récepteurs d'hormones situés dans la membrane plasmique et les systèmes réactionnels intracellulaires.

Les protéines G appartiennent aux GTPases.

Ce sont des protéines hétérotrimétriques liées à la membrane, constituées d'une sous-unités alpha (39 - 46 kDa), beta (35 - 39 kDa) et gamma (8 kDa) .

Les 3 sous-unités sont liées à la membrane : l'extrémité N-terminale de la sous-unité α et l'extrémité C-terminale de la sous-unité γ sont modifiées par des groupements lipidiques myristoyle et isoprényle.

Visualisation de la protéine G hétérotrimèrique complexée au GDP à une résolution de 2,4 Å

Code PDB : 1GG2

Remarques :

• chaîne α : Rattus norvegicus / en jaune / mutant G203A / Gly 2 - Thr 4 et Lys 349 - Phe 354
• chaîne β : Bos taurus / en bleu
• chaîne γ : Bos taurus / en rouge / mutant C68S / tronquée Met 1 - Ala 7 et Arg 62 - Leu 71

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

Les protéines G amplifient le signal :

• chaque récepteur activé par une hormone stimule de nombreuses molécules de protéines G
• chaque complexe [protéine G - enzyme cible] catalyse de nombreuses réactions avant que la protéine G ne soit inactivée.

a. Diversité des sous-unités des protéines G

La diversité des protéines G est moindre que celle des RCPG, mais permet de nombreuses combinaisons entre les sous-unités Gα et Gβ, Gγ.

Il existe au moins (figure ci-dessous) :

• 17 gènes codant la sous-unité Gα
• 5 gènes codant la sous-unité Gβ
• 12 gènes codant la sous-unité Gγ

Les diverses classes de sous unités α :

• la classe G_s ("s" pour stimulateur de l'adénylate cyclase) contient :
  1. quatre types de sous unités α, issues d'un épissage alternatif
  2. la sous unité G_olf (olfacteur) spécifique des récepteurs olfactifs
• la classe G_i/o ("i" pour inhibiteur de l'adénylate cyclase) contient :
  1. deux types de transducine (αt1, αt2 - cellules en bâtonnet et en cône de la rétine) issues d'un épissage alternatif
  2. trois sous unités G_i
  3. trois sous unités G_o ("o" pour "other")
  4. la sous unité G_z
• la classe G_q/11 (stimuleur de la phospholipase C) contient les sous unités G_q, G₁₁, G₁₄, G₁₅et G₁₆

• La famille G₁₂a (régulation du cytosquelette et de certains processus liés au mouvement) contient les sous unités G₁₂et G₁₃

Voir une revue sur l'action de ces différents types de sous unités et celles des sous-unités [β - γ].

Source : S. Martin

b. Activation - désactivation des protéines G

La structure complète d'un complexe RCPG - protéine G_s (PDB : 3SN6) a été publiée en 2011 par l'équipe de B. Kobilka (Prix Nobel 2012) : Rasmussen et al. (2011) "Crystal structure of the β2 adrenergic receptor–Gs protein complex" Nature 477, 549 - 555

Le mécanisme est le suivant : quand une hormone se fixe à son récepteur sur la face externe de la membrane plasmique, celui-ci change de conformation (figure ci-dessous).

Le récepteur peut alors se fixer à une protéine G (inactive - chargée en GDP) située sur à la face interne de la membrane plasmique.

Le GDP est remplacé par le GTP activant ainsi la protéine G.

Les sous-unités β et γ forment un complexe libéré de la sous-unité α après l'échange du GDP en GTP.

Une fois activée, la sous-unité α se dissocie du récepteur et se fixe à son enzyme cible (effecteur) en l'activant.

L'activité phosphatase (dite GTPase) de la sous-unité α hydrolyse le GTP ce qui entraîne la réassociation des sous-unités de la protéine G.

La protéine G retrouve sa conformation liant le GDP et est de nouveau inactive.

L'activité phosphatase / GTPase des protéines G est faible.

Les protéines GAP ("GTPase-Activating Proteins" ou " GTPase-Accelerating Proteins") stimulent l'activité GTPase de la sous-unité α.

Elles contribuent donc à la terminaison du cycle en accélérant l'hydrolyse du GTP (figure ci-contre).

Le cycle GDP/GTP des petites protéines G monomèriques est régulé par :

• la protéine GAP.

• un facteur d'échange GDP/GTP : GEF ("Guanine nucleotide Exchange Factor"). Ce facteur d'échange a donc un effet inverse à celui de GAP puisqu'il favorise la forme GTP des protéines G.

Il existe des petites protéines G monomèriques. Exemples : Ras, Rho, Rab, Ran, Arf, ...

Elles sont impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, le transport, la polarité des cellules pendant leur développement ...

c. La multiplicité des voies de signalisation

1er facteur : le couplage du récepteur à plusieurs sous-types de protéines G différentes.

Le glutamate est un neurotransmetteur excitateur majeur dans les cellules du systéme nerveux central des mammifères. Son action est médiée par un ensemble de récepteurs métabotropes (8 récepteurs "mGlu" classés en 3 groupes ) et ionotropes ("glutamate-gated ion channels" - NMDA, AMPA, récepteurs kaïnate).

Ces récepteurs couplent l'action de protéines G à différents messagers secondaires :

• groupe I (mGlu1 et mGlu5) : couplage vers l'hydrolyse des phosphoinositides via l'activation de la phospholipase C (PLC).

• groupe II (mGlu2 et mGlu3) et groupe III (mGlu 4, 6, 7 et 8) : couplage négatif vers l'adénylate cyclase (inhibition de la synthèse de l'AMP cyclique) et modulation d'un grand nombre de canaux ioniques.

Source : Hermans & Challiss (2001)

Figure ci-dessus : les multiples voies de signalisation activées par le récepteur mGlu1a via son con couplage à différents types de protéines G.

Légende : AC : adénylate cyclase - cAMP : AMP cyclique - PKA : protéine kinase A - PLC : phospholipase C - InsP3 : inositol 1,4,5-triphosphate - DAG : 1,2-diacylglycérol - PKC : protéine kinase C - MAPK : "mitogen-activated protein kinase" - E.R. : réticulum endoplasmique

2ème facteur : la possibilité qu'ont les sous-unités [β - γ] d'agir sur des effecteurs différents, après l'activation et la dissociation des sous-unités d'un seul sous-type de protéine G.

Les sous-unités β et γ n'ont pas de site catalytique : elles agissent donc comme des modulateurs dans la signalisation liée aux protéines G via des interactions protéine - protéine qu'elles régulent.

En conséquence, le complexe [β - γ] agit aussi comme une molécule signal.

C'est le cas par exemple du récepteur [muscarinique / acétylcholine] impliqué dans l'ouverture des canaux à courant potassique GIRK ("G protein-regulated inward rectifier potassium channel") (figure ci-contre).

Source : Wettschureck & Offermanns (2005)

Légende : M2 : récepteur muscarinique; PKA : protéine kinase A; VDCC :"voltage-dependent calcium channel".

Autre exemple : le récepteur histaminique impliqué dans l'activation de la phospholipase A2.

Voir une liste des cibles des sous-unités [β - γ].

d. Les sous-unités [β - γ]

5 gènes codant la sous-unité β et 12 gènes codant la sous-unité γ ont été identifiés chez l'homme et la souris. Il y a une plus grande identité de séquences en acides aminés pour les sous-unités β (80% entre β1 et β4) que pour la sous-unité γ.

Ces différentes isoformes de sous-unités β et γ peuvent s'assembler en différentes combinaisons [β_xγ_y].

Figure ci-contre, structure des sous-unités β et γ. Les numéros correspondent aux différents parties des hélices (en rouge : hélice N-terminale de la sous-unité β / en bleu : hélice N-terminale de la sous-unité γ).

Structure du dimère β1γ1 : PDB 1TBG

Source : Wall et al. (1995)

Les sous-unités β et γ sont des protéines membranaires : l'extrémité C-terminale de la sous-unité γ est isoprénylée par des groupements farnesyle ou géranyle-géranyle liés à une Cys

Ainsi modifié, le complexe [β/γ ] est adressé au réticulum endoplasmique où une protéase ("Rasconverting enzyme" - Rce1) hydrolyse les 3 acides aminés C-terminaux de la sous-unité γ.

Enfin l'isoprényle cystéine carboxy-méthyl transférase catalyse la carboxy-méthylation de l'acide aminé C-terminal de la sous-unité γ et celle-ci est pleinement modifiée post-traductionnellement.

Dans le système de la vision, la rhodopsine (pour les bâtonnets) et 3 opsines distinctes (pour les cônes sensibles aux couleurs) servent de recepteurs pour la lumière.

La molécule qui absorbe le photon est le 11-cis-rétinal lié de manière covalente à une lysine dans la 7è hélice trans-membranaire.

Le récepteur s'associe à une protéine G appelée transducine (αt1, αt2) qui active la phosphodiéstérase (PDE).

Or la PDE hydrolyse le GMP cyclique (GMPc) et la baisse de concentration de GMPc provoque la fermeture d'un canal ionique et l'hyperpolarisation de la cellule.

Des mutations affectant les gènes codant pour les opsines conduisent à ne plus pouvoir distinguer les couleurs (daltonisme).

Le récepteur β-adrénergique s'associe avec la protéine G_s qui le couple à l'adénylate cyclase (AC).

L'AC produit l'AMP cyclique (AMPc) qui exerce ses effets par l'intermédiaire d'une protéine kinase AMPc dépendante.

Dans le système olfactif, les récepteurs des odeurs s'associent à une unique protéine G appelée G_olf.

Cette protéine G couple le récepteur à une forme d'adénylate cyclase propre aux neurones olfactifs.

La formation d'AMPc ouvre un canal ionique Na⁺ - K⁺.

6. Le récepteur de l'insuline

a. Généralités

Il a été découvert dans les années 70 [Freychet et al. (1971) Proc Natl Acad Sci U S A 68, 1833].

Il fait partie de la famille des récepteurs à récepteurs à activité tyrosine kinase, famille subdivisée en une vingtaine de classes.

Parmi les autres membres de cette famille, on peut citer "insulin-like growth factor receptor" (IGF1R) et "insulin receptor related receptor" (IRR).

Figure ci-contre : "INSR" = récepteur de l'insuline.

Source : "Cell Biology promotion"

Les récepteurs à activité tyrosine kinase médient le signal perçu en phosphorylant des tyrosines des protéines cibles.

Le récepteur de l'insuline joue un rôle central dans l'homéostasie du glucose. Le contenu en récepteur de l'insuline est variable. Le niveau d'expression le plus élevé est trouvé dans les cellules impliquées dans le métabolisme du glucose, des lipides et des protéines sous contrôle de l'insuline : les tissus adipeux, les muscles squelettiques et le foie.

b. Maturation du récepteur de l'insuline

La forme non maturée, le pré-pro-récépteur, est une séquence linéaire α - β.

La séquence signal de 27 acides aminés hydrophobes en position N-terminal de la sous-unité α adresse le pré-pro-récépteur au réticulum endoplasmique au sein duquel le peptide signal est hydrolysé.

Le pro-récépteur est ensuite protéolysé par la furine (ou "Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme" - PACE) dans l'appareil de Golgi en deux sous-unités distinctes α et β. Le site de protéolyse est constitué de 4 acides aminés basiques (Arg-Lys-Arg-Arg), après que les deux sous-unités aient été reliées par des ponts disulfure.

La furine est une sérine endoprotéase calcium-dépendante de la famille de la subtilisine.

Le récepteur de l'insuline est une glycoprotéine sous forme d'un dimère de dimère α2β2 (structure PDB 2DTG). Chaque dimère est constitué d'une sous-unité α (partie N-terminale) et d'une sous-unité β transmembranaire.

c. Structure du récepteur α2β2

Cette structure est particulièrement complexe (figure ci-contre et description ci-dessous).

A gauche : représentation des deux sous-unités α et β en fonction des 22 exons du gène codant le récepteur à l'insuline. L'exon 11 subit un épissage alternatif.

A droite : représentation des deux sous-unités α et β sous la forme de modules fonctionnels selon les prédictions de structures secondaires.

• L1 et L2 : grands domaines 1 et 2 qui contiennent des répétitions riches en leucine
• CR : domaine riche en cystéines
• FnIII-1, FnIII-2 et FnIII-3 : domaines fibronectine type III
• ID : domaine d'insertion de 120 acides aminés dans FnIII-2
• TM : domaine transmembranaire
• JM : domaine adjacent à la membrane
• TK : domaine tyrosine kinase
• C : queue C-terminale
• points noirs : principaux sites de N-glycosylation
• points jaunes : sites de fixations de l'insuline
• traits noirs fins : ponts disulfure

Remarque : on trouve d'autres nomenclatures dans la littérature, mais l'ordre est bien évidemment le même.

Source : De Meyts (2008)

Les sous-unité α extracellulaires

• La région est constituée successivement de L1, CR, L2, FnIII-1, FnIII-2 et FnIII-3 (du N-terminal vers le C-terminal).

• ID contient le site de coupure qui génère les sous-unités α et β du récepteur maturé.

• ID contient aussi une séquence de 16 acides aminés (positions 704 à 719 en C-terminale de la sous-unités α) capitale pour la fixation de l'insuline.

• Juste après cette séquence, on trouve une séquence de 12 acides aminés (positions 717 à 729) qui correspond au site d'épissage alternatif (exon 11) : il en résulte 2 isoformes du récepteur de l'insuline (isoforme A : cette séquence est absente / isoforme B : cette séquence est présente).

Les sous-unité β

Le domaine transmembranaire (riche en hélice) est suivi par un domaine adjacent à la membrane. Le domaine tyrosine kinase et queue C-terminale sont intracellulaires.

Les ponts disulfure

• Les sous-unités α sont reliées par des ponts disulfure au niveau de la Cys 524 dans FnIII-1 et au niveau des Cys 682, Cys 683 et Cys 685 dans le domaine d'insertion ID.
• Un pont disulfure unique entre la Cys 647 (FnIII-2) et la Cys 872 (FnIII-3) relie les sous-unités α et β.

d. Exemples de voies de signalisation liées au récepteur de l'insuline

La fixation de l'insuline sur le récepteur de l'insuline induit une autophosphorylation de plusieurs tyrosines de la sous-unité β intracellulaire : tyrosines 965 et 972 (domaine JM), tyrosines 1158, 1162 et 1163 (domaine TK), tyrosines 1328 et 1334 (domaine C).

Cette autophosphorylation induit des changements de conformation qui, à leur tour, induisent l'activation de l'activité tyrosine kinase. Le récepteur de l'insuline peut alors phosphoryler différentes protéines cibles.

Bien que liées, l'autophosphorylation et l'activation du domaine tyrosine kinase sont deux aspects distincts du fonctionnement du récepteur de l'insuline : ils peuvent être découplés et sont soumis à différents mécanismes de régulation.

Parmi les protéines cibles, on peut citer "insulin receptor substrate" (IRS-1 et IRS-2), "Src homology collagen" (Shc) et APS ("adaptor protein" avec un domaine SH2).

L'activité tyrosine kinase du récepteur de l'insuline stimule, entre autres, l'activité kinase de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) .

L'augmentation rapide de la concentration de l'inositol triphosphorylé (PIP3) déclenche une cascade de Ser/Thr protéines kinases PIP3-dépendantes.

Source : Qiagen

Parmi ces dernières, Akt (ou Ser/Thr protéine kinase B) et des isoformes atypiques de la protéine kinase C semblent impliquées dans :

• la régulation du transport du glucose
• la synthèse du glycogène stimulée par le récepteur de l'insuline via IRS-1. Dans ce cas, c'est le domaine SH2 de la phosphatidylinositol 3-kinase qui se fixe à la tyrosine phosphorylée de IRS-1.
• la synthèse des lipides et des protéines
• la modulation de l'expression des gènes : la forme activée de IRS-1 agit comme un second messager impliqué dans l'activation de la transcription des gènes régulés par l'insuline.

L'existence d'un grand nombre de [Ser/Thr protéines kinases PIP3-dépendantes / insulino-dépendantes] renforce l'hypothèse que différentes voies métaboliques sont nécessaires pour réguler les différentes actions biologiques de l'insuline.

La déphosphorylation du récepteur de l'insuline par les protéines tyrosine phosphatases (PTP) est responsible de la désactivation de son activité tyrosine kinase. Exemples de PTP dans le muscle squelettique : les "leukocyte common antigen-related phosphatases" (LAR) et la PTP-1B.

e. Coopérativité négative de la fixation de l'insuline à son récepteur

Selon les études et/ ou les modèles théoriques, 1 ou 2 molécules d'insuline se fixe(nt) par récepteur.

La coopérativité négative est l'opposé de la coopérativité : la fixation d'une première molécule de ligand sur un site diminue l'affinité d'une seconde molécule de ligand pour son propre site.

La coopérativité négative ramène donc la sensibilité d'une protéine aux variations de concentration de son substrat et/ou effecteur à celle d'une protéine au comportement Michaelien (saturation hyperbolique).

En revanche, elle élargit la gamme de concentrations dans laquelle cette protéine va agir en réponse à la fixation de son substrat et/ou effecteur.

Par exemple, la cytidine triphosphate (CTP) est à la fois le produit final d'une série de réactions dont le point de départ est catalysé par la carbamyl-phosphate synthétase et un inhibiteur allostérique négatif de cette enzyme. Or cette enzyme est un carrefour à partir duquel un grand nombre de métabolites autres que la CTP sont synthétisés.

Il n'est pas concevable qu'une inhibition de cette enzyme par la CTP soit totale, car ce serait au détriment de la synthèse des autres métabolites.

La coopérativité négative de la fixation du CTP permet donc que, même en trés large excès, l'inhibition de la carbamyl-phosphate synthétase ne soit pas totale.

La coopérativité négative semble liée à certaines protéines qui sont des point de branchement dans le réseau de régulation métabolique : ce concept s'applique à certains couples [ligand - récepteur] comme le couple [insuline - récepteur de l'insuline].

Base de données : "GPCRDB: Information system for G protein-coupled receptors (GPCRs)"

Base de données : "Ligand-Gated Ion Channels Database" - EBI

Aller à la base de données : "Orientation of Proteins in Membranes"

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