1. L'ion calcium et la calmoduline

2. Séquences nucléotidiques et polypeptidiques (primaires) de la calmoduline

3. Structure de la calmoduline

a. Structure tridimensionnelle

b. Le motif "EF - hand"

4. Visualisation de la calmoduline (nécessite que votre navigateur soit compatible avec le "plug-in CHIME")

5. Mécanisme de changement de conformation de la calmoduline

a. lors de la fixation coopérative du calcium

b. lors de l'interaction avec les protéines cibles

6. Exemples de complexe calmoduline - protéine

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. L'ion calcium et la calmoduline

L'ion calcium (Ca²⁺) est le métal le plus abondant dans le corps humain (2 % du poids total).

Il joue un rôle important dans la coagulation du sang, la contraction musculaire, le relarguage de neurotransmetteurs, la mobilité du cytosquelette, ...

Le rayon ionique du calcium est plus important que celui d'autres ions métalliques trouvés dans les organismes (Na⁺, K⁺, Mg²⁺). Son enveloppe électronique lui permet d'établir 6 à 8 liaisons de coordination avec les protéines avec cependant un bon degré de fléxibilité. Il se fixe donc fréquemment dans des "poches" constituées d'acides aminés acides (Asp et Glu, Asn), ce qui ne contraint pas ou peu la conformation du squelette carboné.

Dans une cellule au repo", la concentration du calcium libre et d'environ 50 à 100 nM. Un stimulus externe peut induire une augmentation de la concentration à 10 µM.

L'ion calcium est un messager intracellulaire trés important.

• il intervient dans de nombresuses voies de transduction du signal et joue un rôle clé dans la régulation du métabolisme en contrôlant, directement ou indirectement., l'activité biologique de nombreuses protéines
• l'ion calcium se fixe à certaines protéines et cette fixation induit un changement de conformation de ces protéines

La découverte d'une protéine régulatrice de la phosphodiestérase (Cheung, 1970) a contribué à la compréhension du mécanisme d'action du calcium :

• en effet, cette protéine régulatrice intervient comme médiateur de la régulation par le calcium dans de trés nombreux systèmes animaux et végétaux
• comme sa fixation au CALcium MODULe l'activité de nombreuses protéines, cette protéine régulatrice a été baptisée calmoduline (CaM) (Means & Dedman, 1980)
• elle possède (dans la plupart des cas) quatre sites de fixation du calcium
• quand la calmoduline a fixé 4 ions calcium, elle adopte une nouvelle conformation qui lui permet d'interagir avec d'autres protéines cibles afin de les activer

2. Séquences nucléotidiques et polypeptidiques (primaires) de la calmoduline

L'alignement de séquences de la CaM révèle des résultats surprenants.

a. Séquences nucléotidiques

Séquence consensus codant la CaM issue de 44 séquences de CaM de plantes (E. Jaspard - non publié)

ATGGC.GAtc agCTcAccGA cGA.CAGAtc tc.GAgTTcA AgGAgGCcTT caGCcT.TTc GAcAAgGA.G GcGAtGGtTG cATcAC.ACc AAGGAgcTtG GaACtGTgAT GcG.TCacTg GG.CAgAAcC CaACtGAgGC tGAgCT.CAg GAcATGATcA AtGAaGTtGA TGCtGATGG. AAtGGaACcA TtGAcTTcCC .GAGTTccT. AAccTgATGG C.cG.AAgAT GAAgGAcACt GAtTCtGAGG AgGAgCTcAA gGAgGCtTTC ag.GTgTTtG AcAAgGAtCA gAAtGG.TTc ATcTCtGCtG CtGAgcT.CG cCAtGT.ATG AC.AAcCT.G G.GAgAAgCT .AC.ga.ga. ..aGAgGTtG AtGAGATGAT ccg.GAgGCt GAtgT.GAtG GtGATGG.CA gaTcAAcTAt GAgGAgTTtG TcAAggTcAT GATGGCcAAG TGA 453

• les nucléotides en majuscule sont trouvés à la position indiquée dans toutes les séquences : c'est-à-dire un taux d'identité tout à fait exceptionnel de 66%, puiqu'il s'agit de séquences nucléotidiques (il faut tenir compte de la dégénérescence du code génétique)
• minuscule: 1 seule séquence ne présente pas le nucléotide à cette position
• point: au moins 2 séquences ont un nucléotide qui diffère de la séquence consensus
• chez les végétaux, le codon initiateur ATG est inclu dans une région riche en AT, contenant des séquences consensus TATA box et CAAT box ; chez les animaux, cette région est dépourvue de TATA box et elle est riche en GC
• la séquence codante est composée de 2 exons séparés par 1 intron de 1,5 à 2,7 kilo paires de bases situé au niveau du 26è codon (glycine)

Il existe plusieurs gènes codant la CaM (8 clones génomique chez la pomme de terre, par exemple) :

• ceci est liée à la necessité d'un contrôle transcriptionnel trés fin de cette protéine du fait de son implication majeure dans la transduction de signaux, notamment lors de la prolifération et de la différenciation cellulaire
• celà constitue aussi une protection contre toutes mutations de la CaM qui s'avèrerait léthale s'il n'existait qu'une copie du gène
• enfin, l'existence d'isoformes (6 chez Arabidopsis thaliana) augmente l'éventail de conformations que la CaM peut adopter et donc de protéines avec lesquelles elle peut interagir

La CaM est une protéine assez petite constituée d'une chaîne polypeptidique de 148 - 149 acides aminés (de masse molaire d'environ 16.700 Dalton).

Séquence primaire consensus de la CaM issue de 39 séquences de CaM de plantes (E. Jaspard - non publié)

A..L...Q.. ..KEAF.LFD KDGDGCIT.. E..TV.RSL. QNPTE.ELQD MI.E.D.D.N GTI.F.E.L. LMA.K.K.TD .EE.LKEAF. VFDKDQ.G.I SA...RHVM. NLGEKL... EV..MI.EAD .DGDGQ.N.. EFV..M... 149

• là encore, les acides aminés en majuscule sont trouvés à la position indiquée dans toutes les séquences, soit un taux d'identité trés élevé (65%)
• point : au moins deux séquences ont un acide aminé qui diffère de la séquence consensus

3. Structure de la calmoduline

a. Structure tridimensionnelle

La figure ci-dessous représente la calmoduline de Paramecium tetraurelia qui fixe 5 atomes de calcium ce qui est un cas cas particulier.

• 1 domaine N-terminal
• 1 domaine central : une hélice de 7 tours
• 1 domaine C-terminal

Le domaine N-terminal et le domaine C-terminal possèdent 2 (voire 3) sites de fixation du calcium :

• ces sites ont une structure trés particulière appelée "EF-hand", mise en évidence pour la première fois chez la parvalbumine (protéine du muscle qui fixe le calcium)

• c'est un motif hélice - boucle - hélice

Source : http://ead.univ-angers.fr/~jaspard

Ce motif est composé de 30 acides aminés et contient 2 hélices α (E et F - figurées respectivement par l'index et le pouce d'une main - figure ci-contre), reliées par une boucle.

Lors de la fixation du calcium, l'hélice F passe d'une conformation "fermée" (apo-CaM en gris clair) à une conformation "ouverte" (holo-CaM en gris foncé).

Dans la CaM, les 4 boucles de liaison de ces motifs ont des séquences homologues :

D/N - x - D - G - D/N - G - T/Y/Q - x - x - x - x - E

Source : Lewit-Bentley & Réty (2000)

7 atomes d'oxygène constitue le réseau de coordination du calcium :

• 5 proviennent de la chaîne latérale d'Asp et de Glu
• le 6ème provient du groupement carbonyle de la liaison peptidique impliquant une Gln
• le 7ème provient d'une molécule d'eau

Géomètrie des ligands du calcium dans un motif "EF - hand":

Source : Lewit-Bentley & Réty (2000)

4. Visualisation de la calmoduline de l'homme, non complexée au calcium, à une résolution de 1,7 Å

Code PDB : 1CLL

Acides aminés des 4 motifs "EF - hand" :

• EF1 : X = D20 (OD2); Y = D22 (OD1); Z = D24 (OD2); -X = H2O; -Y = T26 (O); -Z1 = E31 (OE1); -Z2 = E31 (OE2)
• EF2 : X = D56; Y = D58; Z = N60; -X = H2O; -Y = T62; -Z1 = E67; -Z2 = E67
• EF3 : X = D93; Y = D95; Z = D97; -X = H2O; -Y = Y99; -Z1 = E104; -Z2 = E104
• EF4 : X = D129; Y = D131; Z = D133; -X = H2O; -Y = Q135; -Z1 = E140; -Z2 = E140

Cliquer sur les acides aminés puis sur le bouton sphères ou batonnets ou "0%" pour faire disparaitre les sphères.

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

5. Mécanisme de changement de conformation de la calmoduline

a. Lors de la fixation coopérative du calcium : apo-calmoduline (sans calcium) <---> holo-calmoduline (4 atomes de calcium)

1. elle fixe 4 atomes de calcium de manière séquentielle : il y a un effet coopératif (figure ci-contre) dans la fixation des 4 atomes de calcium (voir le cours sur les protéines à régulation allostérique).

Les 4 sites de fixation lient le calcium avec une trés grande affinité mais avec des constantes de dissociation différentes : K_D = 5 10^-7 M à 5 10^-6 M.

Les sites du domaine C-terminal ont une affinité plus grande que ceux du site N-terminal.

Divers modèles mathématiques décrivant la fixation coopérative du caclium la calmoduline ont été développés.

Source : Stefan et al.(2008)

2. La fixation des atomes de calcium induit un changement de conformation de la CaM et notamment fait apparaître une longue hélice centrale.

3. La CaM adopte alors une conformation activante : c'est dans cette conformation qu'elle interagit avec ses protéines cibles pour en moduler l'activité.

On peut schématiser le changement de conformation qui s'opère sous forme d'une "haltère" qui se replie sur elle-même ("pince").

La CaM saturée en calcium s'enroule autour de régions spécifiques de la protéine cible.

Structure du complexe CaM - peptide de la CaM kinase I calcium dépendante.

Les résidus Phe²⁹⁸ à Arg³¹⁷ du peptide adoptent une conformation en hélice.

Le peptide est en rouge et les ions calcium en vert.

Source : Clapperton et al. (2002)

Source : Clapperton et al. (2002)

Les équilibres de :

• fixation du calcium à la calmoduline

• fixation de la calmoduline à la protéine cible

• changements de conformations qui les accompagne

peuvent être écrits de la manière suivante :

CaM_haltère + Ca²⁺ <--> Ca²⁺-CaM <--> (Ca²⁺)₄-CaM_pince

EnzCible_inactive + (Ca²⁺)₄-CaM_pince <--> [EnzCib)(Ca²⁺)₄-CaM)]_active

6. Exemples de complexe calmoduline - protéine

Plusieurs dizaines de types de protéines sont recensées comme interagissant avec la calmoduline :

voir le tableau (avec les liens vers des données sur ces protéines)

En particulier, on peut citer :

• l'adénylate cyclase
• les kinases II calcium/calmoduline-dépendantes : voir CaM-kinases II

voir des structures de complexes

Cheung, W. Y. (1970) "Cyclic 3'-5'-nucleotide phosphodiesterase : demonstration of an ctivator" Biochem. Biophys. Res. Commun. 38, 533 - 538

Means, A. R. & Dedman, J. R. (1980) "Calmodulin : an intracellular calcium receptor" Nature 285, 73 - 77

Lewit-Bentley, A. & Réty, S. (2000) " EF-hand calcium-binding proteins" Curr. Op. Struct. Biol., 10, 637 - 643

Carafoli E. (2002) "Calcium signaling : A tale for all seasons" Proceed. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1115 -1122

Clapperton et al. (2002) Biochemistry 41, 14669 -14679

Stefan et al. (2008) "An allosteric model of calmodulin explains differential activation of PP2B and CaMKII" Proc Natl Acad Sci 105, 10768 - 10773

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