1. La phosphorylation

2. Les familles de protéines kinases

3. Les spécificités de substrat et quelques motifs consensus de phosphorylation

4. La sous-unité calalytique des protéines kinases

5. La déphosphorylation par les protéines Ser/Thr ou Tyr phosphatases

6. Mécanisme d'activation de certaines protéines kinases

7. Exemple de cascade de phosphorylation

8. Les protéines kinases calcium/calmoduline dépendantes - CaM kinases II (animaux)

9. Les protéines kinases calcium dépendantes - CDPK (plantes)

10. La protéine kinase A (voir une animation : activation PKA par l'AMPc)

11. Généralités sur les MAP-kinases

12. Les MAP kinases p38

13. Modulation de l'activité et de la localisation des facteurs de transcription NFAT

14. Liens Internet et références bibliographiques

1. La phosphorylation

C'est une modification post-traductionnelle capitale des protéines, qui intervient dans un trés grand nombre de processus cellulaires (différenciation, division, prolifération, apoptose, ...) et en particulier dans les mécanismes de signalisation.

Le processus de phosphorylation est connu depuis plus d'un siècle (Levene & Alsberg, 1906) suivi de la mise en évidence d'une phosphosérine dans la vitelline (Lipmann & Levene, 1932) puis de la première description de la phosphorylation d'une protéine (Burnett & Kennedy, 1954).

La phosphorylation induit des modifications structurales donc fonctionnelles trés importantes de la protéine cible qui ont pour conséquences (entre autres) :

• une augmentation ou une inhibition de son activité enzymatique
• un changement de sa localisation cellulaire dans certains cas (facteurs de transcription par exemple)
• l'association avec d'autres protéines

La phosphorylation est une modification qui est réversée par la déphosphorylation catalysée par les protéines phosphatases.

Le taux de phosphorylation de la sérine, de la thréonine ou de la tyrosine est respectivement de 1000 / 100 / 1.

Bien que quantitativement moins importante, la phosphorylation de la tyrosine a une incidence biologique importante.

Par exemple, l'activité d'un grand nombre de facteur de croissance est contrôlée par la phosphorylation de cet acide aminé.

2. Les familles de protéines kinases

Les 27 familles de protéines kinases constituent l'une des plus vastes et importantes super-familles de protéines.

Elles représentent environ 2% des gènes dans bon nombre de génomes d'eucaryotes.

Elles interviennent dans la régulation de la plupart de toutes les voies métaboliques et semblent phosphoryler environ 30% du protéome !

• environ 2000 kinases sont recencées
• plus de 100 structures tri-dimensionnelles ont été résolues

Les protéines kinases catalysent les réactions de phosphorylation.

Rappel : EC 2 = transférases - EC 2.7 = transfert de groupe contenant un phosphore.

les protéines tyrosine kinases

les protéines sérine / thréonine kinases (EC 2.7.11.1)

Plus de 90 protéines tyrosine kinases sont recencées dans le génome humain et forment une trés vaste famille multigènique.

Les protéines tyrosine kinases sont divisés en 2 groupes :

a. les protéines tyrosine kinases cytoplasmiques (32 de ce type - EC 2.7.10.2).

b. les protéines tyrosine kinases récepteurs transmembranaires ("transmembrane receptor-linked kinases" - 58 de ce type / EC 2.7.10.1 - EC 2.7.1.112).

Exemple : le récepteur de l'insuline.

Elles sont constituées d'un domaine extracellulaire qui fixe un ligand spécifique, d'un domaine transmembranaire et d'un domaine catalytique intracellulaire qui fixe et phosphoryle les protéines cibles.

La fixation du ligand au domaine extracellulaire entraîne des modifications structurales des protéines tyrosine kinases, ce qui les activent.

Quelques exemples :

• les protéines kinases regulées par les nucléotides cycliques (AMP cyclique - GMP cyclique) : protéine kinase A (PKA) & protéine kinase G

• la protéine kinase activée par le diacylglycérol : protéine kinase C (PKC)

• les MAP kinases ("Mitogen-activated protein kinases" - EC 2.7.11.24) : ERK ("Extracellular signal-Regulated Kinase"), c-jun N-terminal kinase, MAP kinase p38

• les protéines kinases [calcium - calmoduline] dépendantes (CaM kinases) chez les animaux

• les protéines kinases calcium dépendantes (CDPK - "Calcium-Dependent Protein Kinases") chez les plantes et les protozoaires

• la glycogène phosphorylase kinase (EC 2.7.11.19)

les protéines histidine kinases (EC 2.7.13.3)

Elle n'ont pas de point commun du point de vue structural avec les autres protéines kinases et sont trouvées essentiellement chez les procaryotes et les plantes.

Elles fonctionnent en "relai" avec un résidu aspartate qui reçoit le groupement phosphoryle préalablement transféré de l'ATP sur l'histidine.

Différences avec Arabidopsis thaliana (plantes)

Le génome de Arabidopsis thaliana code pour environ 1100 protéines kinases, soit 4% des 25.500 gènes prédits. Cette proportion est donc le double de celle observée chez l'homme, chez Saccharomyces cerevisiae ou chez Caenorhabditis elegans.

Chez Arabidopsis thaliana, les protéines kinases récepteurs transmembranaires phosphorylent les résidus Ser et Thr (elles phosphorylent essentiellement les Tyr chez les animaux - voir ci-dessus).

Les deux principaux types de kinases qui médient le signal calcique chez les animaux, les protéines kinases calcium / calmoduline dépendantes (CaM kinase) et la protéine kinase C, semblent absentes ou sous-représentées chez Arabidopsis thaliana.

3. Les spécificités de substrat et quelques motifs consensus de phosphorylation

Des analyses bioinformatiques et statistiques des séquences primaires d'un trés grand nombres de substrats de protéines kinases ont montré que les 4 acides aminés (au moins) en amont et en aval du site phospho-accepteur ont une influence sur la sélection du substrat par les protéines kinases.

Les caractéristiques physico-chimiques des chaînes latérales de ces 8 acides aminés indiquent que :

a. les protéines sérine / thréonine kinases peuvent être schématiquement classées en 3 catégories :

• acidophiles (exemple : caséine kinase)
• basophiles (kinases calmoduline dépendantes, PKA, PKC)
• dirigée par la proline ("proline-directed") (exemple : MAP kinase P38, kinases cycline dépendantes)

b. les protéines tyrosine kinases sont davantage acidophiles

Exemples de motifs consensus de phosphorylation (Schwartz & Gygi, 2005)

sérine kinases

thréonine kinases

tyrosine kinases

RXRXXSP (cas général)

TPP

T₁₈₀[EPG]Y₁₈₂ (MAP kinases - double phosphorylation)

EXXY

S/TPX[KR] (kinases cycline dépendantes)

Y[DS]

S/TDX[DE] (caséine kinase II)

YXXP

4. La sous-unité calalytique des protéines kinases

La sous-unité catalytique des protéines kinases (qu'elles soit Tyr ou Ser / Thr) est extrêmement conservée du point de vue structural, ce qui permet de mettre au point un grand nombre d'inhibiteurs dans le but de traiter des maladies.

510 séquences de protéines kinases de l'homme ont été comparées et fournissent les données suivantes (Source : Kostich et al., 2002) :

• le sous-domaine I (acides aminés 43 à 64) : l'extrémité N-terminale des protéines kinases contient un motif riche en Gly : GXGX[FY]GXV ("Glycine-rich loop") qui forme une boucle en épingle à cheveux qui englobe la partie triphosphate de l'ATP.

• le sous-domaine II (acides aminés 65 à 83) contient une Lys conservée impliquée dans la fixation du groupement phosphate en position β de l'ATP.

• le sous-domaine III (acides aminés 84 à 98) contient un Glu qui établit un pont salin avec la Lys pour stabiliser sa conformation.

• le sous-domaine VIB (acides aminés 161 à 177) contient le motif HRDLKPXN dans le cas des protéines sérine / thréonine kinases et le motif HRDLXARN dans le cas des protéines tyrosine kinases. L'Asp et l'acide aminé basique (Lys ou Arg) qui le suit sont impliqués dans la catalyse, c'est-à-dire la phosphorylation du substrat. L'atome d'azote en position ε de la Lys ou de l'Arg interagit avec le groupement OH de l'accepteur de groupement phosphate.

Superposition des sites de fixation de l'ATP et du magnésium (magenta) de la MAP-kinase p38 (jaune) et de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (rouge).

Source : Wilson et al. (1996)

Boucle catalytique et boucle d'activation de la protéine kinase A.

Trois résidus catalytiques sont mis en évidence : D166, K168 et N171.

Source : Kornev et al. (2008)

• le sous-domaine VII (acides aminés 178 à 193) contient le motif DFG impliqué également dans la catalyse. L'Asp est lié à du magnésium qui fixe 2 groupements phosphate de l'ATP.

• le sous-domaine VIII (acides aminés 194 à 210) contient le motif TXXYXAPE dans le cas des protéines sérine / thréonine kinases et le motif PXXWXAPE dans le cas des protéines tyrosine kinases. Ce motif est capital pour la stabilisation de différentes conformations de la boucle d'activation impliquée dans la fixation de la protéine substrat. Les acides aminés Thr et Pro se positionnent juste au dessous des acides aminés du site accepteur (Ser/Thr, Tyr). Dans le cas des protéines tyrosine kinases, la Pro force la boucle d'activation à se tourner afin d'orienter convenablement la Tyr acceptrice.

• l'Asp du sous-domaine IX (acides aminés 211 à 240) établit une liaison hydrogène avec le groupement aminé de la chaîne des carbones α pour stabiliser la conformation de la boucle catalytique du sous-domaine VIB (acides aminés 161 à 177).

• une Arg du sous-domaine XI (acides aminés 261 à 297) forme un pont salin avec le Glu en position C-terminal du motif du sous-domaine VIII. Remarque : la caséine kinase 1 ne possède pas ce pont salin du fait d'une mutation du Glu en Gln.

De tous les motifs, c'est le motif riche en Gly qui est le plus variable entre les séquences de protéines kinases. Les autres sont conservés à 95%.

Remarque : la numérotation des acides aminés pour chaque sous-domaine mentionnée ci-dessus est celle de la sous-unité catalytique de la protéine kinase A.

5. La déphosphorylation par les protéines Ser/Thr ou Tyr phosphatases

La phosphorylation est le plus souvent transitoire.

Le ou les groupement(s) ajoutés sont ensuite clivés : la déphosphorylation est catalysée par les protéines phosphatases.

La plupart des protéines kinases ont une phosphatase qui leur est associée.

La phosphorylation - déphosphorylation est donc :

• un mécanisme impliqué dans la régulation de l'activité biologique de certaines protéines

• un moyen de contrôler finement le flux d'une voie métabolique

Sur la base de leur homologie de séquences en acides aminés, de leurs structures 3D et de leurs sensibilités aux inhibiteurs, les protéines phosphatases sont classées en 4 familles :

• les phospho-protéines phosphatases : enzymes spécifiques des Ser/Thr phosphorylées

• les protéines phosphatases magnésium-dépendantes : enzymes spécifiques des Ser/Thr phosphorylées

• Les phosphatases à aspartate : enzymes spécifiques des Ser/Thr phosphorylées

• les protéines tyrosine phosphatases : elles peuvent déphosphoryler les 3 résidus phosphorylés ("dual specificity phosphatases"). Exemple : les MAP kinase phosphatases.

Bien qu'il y ait peu d'homologie entre les séquences en acides aminés des protéines Ser phosphatases et des protéines Thr phosphatases, la structure de leur domaine catalytique est similaire.

Elle est en revanche trés différente de celle des protéines Tyr phosphatases.

Figure ci-contre : Comparaison des 3 familles de protéines Ser/Thr phosphatases.

• PPP : phospho-protéines phosphatases
• PPM : protéines phosphatases magnésium-dépendantes
• phosphatases à aspartate : FCP ("TFIIF-associating component of RNA polymerase II CTD phosphatase") et SCP ("small CTD phosphatase")

Les séquences des motifs signature sont indiqués au dessus des diagrammes.

Les domaines catalytiques de chaque protéine sont indiqués en dessous des diagrammes.

Les famille PPP et PPM contiennent 3 motifs caractéristiques au sein du domaine catalytique conservé : GDxHG, GDxVDRG, et GNHE.

Les acides aminés impliqués dans la coordination au métal et dans la fixation du phosphate sont colorés en rouge et en bleu, respectivement.

Source : Shi Y. (2009)

Différentes phosphatases et leur nomenclature

• PP1 : protéines Ser/Thr phosphatase de type 1
• PP4 (ou PPX), PP5, PP6 (homologue de Sit4 de la levure), PP7 : protéines Ser/Thr phosphatases de type 4 à 7, respectivement
• PP2A, PP2B, PP2C : protéines Ser/Thr phosphatases de type 2A, 2B et 2C

A l'exception de PP2B et PP2C, elles sont inhibées spécifiquement par les microcystines (famille de toxines peptidiques cyclique des cyanobactéries).

Les protéines Ser/Thr phosphatases de type 1 (PP1)

Ce sont des phosphatases majeures et ubiquitaires dans toutes les cellules eucaryotes.

Les séquences des sous-unités catalytiques sont très conservées au sein des eucaryotes (environ 70% ou plus d'identité de séquences).

Elles ont une structure 3D conservée.

Plus de 100 sous-unités régulatrices ont été identifiées.

L'analyse des sous-unités R d'un grand nombre d'eucaryotes suggère un accroissement du nombre de sous-unités R concomitant avec l'évolution des organismes multicellulaires.

Les sous-unités R pourraient :

• adresser la sous-unité catalytique à des compartiments cellulaires spécifiques
• moduler la spécificité de substrat
• ou même servir de substrat elles-mêmes

Les associations in vivo des sous-unités catalytiques de PP1 (ou de PP2A) avec différentes sous-unités R génèrent un vaste ensemble de protéines appelées holoenzymes.

Ces holoenzymes sont différentiellement exprimées.

En conséquence, les interactions entre ces deux types de sous-unités sont capitales pour les trés nombreux processus cellulaires dans lesquels les PP1 sont impliquées :

• la régulation du métabolisme
• la réplication et la transcription de l'ADN, l'épissage des ARN et leur traduction
• la meïose et la division cellulaire
• l'apoptose, la synthèse des protéines, la réorganisation du cytosquelette
• la régulation de l'activation de certains récepteurs membranaires et des canaux
• ...

• la sous-unité catalytique de PP1 (en bleu) adopte une structure repliée compacte de type α/β, avec un "sandwich" β calé entre 2 domaines riches en hélices.
• les 3 domaines ("sandwich" β, petit et grand domaines hélicaux) forment un "sillon" en forme de "Y" (en rose) : le point de convergence correspond au site actif.
• le site actif contient deux cations : Mn2+ et Fe2+ (petites sphères rouges). Les deux cations fixent et activent une molécule d'eau qui est à l'origine de l'attaque nucléophile de l'atome de phosphore.
• un inhibiteur, l'acide okadaïque (dérivé d'acide gras) est fixé à la sous-unité catalytique (en jaune) .

Source : Shi Y. (2009)

• à gauche : schéma de coordination des deux cations de PP1. 3 His, 2 Asp et 1 Asn établissent des liaisons de coordination avec ces deux cations.
• à droite : alignement de ces 6 acides aminés de PP1 et de ceux des autres membres de la famille PPP. Ces acides aminés sont très conservés chez tous les membres de la famille PPP, ce qui suggère un mécanisme commun de réaction catalysée par un métal.

Source : Shi Y. (2009)

Remarque : les protéines tyrosine phosphatases mettent en jeu une cystéine qui forme un intermédiaire phospho-cystéine avant l'attaque nucléophile de l'atome de phosphore par une molécule d'eau.

Figure ci-contre : structure du domaine catalytique de PP1 (en bleu) lié à la sous-unité régulatrice de la protéine d'adressage de la phosphatase de la myosine (MYPT1 - en vert).

3 motifs de MYPT1 sont impliqués dans les interactions :

• le motif VxF qui se fixe à la surface hydrophobe conservée de PP1 (vue détaillée en encart)
• un domaine ankyrine qui coiffe l'extrémité C-terminale de PP1
• une hélice hydrophobe N-terminale qui s'empile sur la surface de PP1

Source : Shi Y. (2009)

6. Mécanisme d'activation de certaines protéines kinases

Chaque protéine kinase dans la figure ci-dessous possède une sous-unité régulatrice (R) qui contient un domaine pseudo-substrat mimant un substrat réel.

Ce domaine pseudo-substrat occupe le site catalytique de la sous-unité catalytique (C) et l'inhibe.

Dans le cas des protéines kinases calcium / calmoduline dépendantes et de la protéine kinase C, le domaine pseudo-substrat fait partie de la chaîne polypeptidique globale qui constitue la kinase.

Source : "ADN recombinant" Watson et al. (1994) - Ed. DeBoeck - ISBN 2-8041-1597-6

Dans chacun des cas, la fixation des ligands qui activent ces kinases induit un changement de structure qui dissocie le domaine pseudo-substrat du site catalytique.

Voir une animation de l'activation des protéines kinases A par l'AMPc.

Ces ligands sont respectivement :

• l'AMP cyclique (AMPc)
• la calmoduline
• le diacylglycérol (DAG)

Les protéines tyrosine kinases peuvent s'autophosphoryler au niveau du segment d'activation de leur domaine kinase. Ce processus induit un changement de conformation qui les active.

Exemples de domaines de fixation dépendants de la phosphorylation : protéines 14-3-3, "Src homology 2" (SH2), "phosphotyrosine binding" (PTB), "BRCA1 C-terminal" (BRCT).

7. Exemple de cascade de phosphorylation : la glycogènolyse

• la glycogène synthase
• la glycogène phosphorylase

des cellules hépatiques en réponse au relarguage du glucagon du pancreas.

La phosphorylation :

• inhibe l'activité de la glycogène synthase, donc arrète la synthèse de glycogène
• augmente l'activité de la glycogène phosphorylase, donc active la dégradation du glycogène

8. Les protéines kinases calcium/calmoduline dépendantes - CaM kinases II (animaux)

Quand la calmoduline a fixé 4 ions calcium, elle adopte une nouvelle conformation qui lui permet d'interagir avec d'autres protéines cibles afin de les activer.

En particulier, la kinase II calcium/calmoduline-dépendante ou CaM-kinase II (EC 2.7.1.123) :

• Elle fait partie d'une sous-famille des Ser/Thr kinases qui contient (entre autres) : la CaM-kinase I, la CaM-kinase IV, la phosphorylase kinase, la kinase de la chaîne légère de myosine.

• Elle intervient dans la stimulation des synapses des neurones. Dans certaines régions du cerveau, elle représente jusqu'à 2% des protéines totales. L'activation de la CaM kinase II semble liée aux processus de la mémoire et de l'apprentissage.

• La CaM kinase II est un complexe de 12 sous-unités avec une masse molaire estimée de 550 à 660 kDa !

• Il existe 4 isoformes de CaM kinase II codées par des gènes distincts : isoforme α - 478 acides aminés - 54 kDa / isoforme β - 60 kDa / isoformes γ et δ.

La CaM kinase II possède :

• un domaine N-terminal catalytique (domaine kinase - acides aminés 1 à 315),
• un domaine de régulation auto-inhibiteur (acides aminés 346 à 478) et
• un domaine d'association entre les 12 sous-unités du complexe

Visualisation de la Cam-kinase II de Homo sapiens à une résolution de 2,3 Å (2010).

PDB : 2VZ6

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

a. La fixation de la calmoduline (compléxée au calcium) au domaine de régulation de la CaM-kinase II lève le pouvoir auto-inhibiteur de ce domaine et active le domaine catalytique.

b. La CaM-kinase II ainsi activée s'autophosphoryle sur la thréonine 286.

c. Une diminution du taux de Ca2+ entraîne une dissociation de la calmoduline de la CaM-kinase II, cette dernière demeurant active.

d. L'hydrolyse du groupement phosphate du domaine auto-inhibiteur par la protéine phosphatase 1 inactive de nouveau la CaM-kinase II.

e. La protéine kinase A régule l'activité déphosphorylante de la protéine phosphatase 1.

9. Les protéines kinases calcium dépendantes - CDPK (plantes)

Les CDPK sont des des Ser/Thr kinases.

Chez les plantes et les protozoaires, les protéines kinases calcium dépendantes (" Calcium-dependent protein kinases" - CDPK - EC 2.7.11.1) médient le signal calcique.

Il semble que le génome de Arabidopsis thaliana contient 34 gènes codant cette enzyme.

Riz : MM CDPK riz = 56,7 kDa / 514 acides aminés / pI = 5,18

Les CDPK ont une structure hautement conservée.

Leur structure est différente de celle des CaM kinases. En effet, les CDPK possèdent (figure ci-dessous) :

• une extrémité N-terminale ("N") trés variable.

• un domaine catalytique (domaine kinase).

• un domaine de "jonction" autoinhibiteur (noté "A"). L'inhibition a lieu en absence de calcium.

• un domaine de régulation C-terminal qui ressemble à la calmoduline (noté "CaM-like"). Ce domaine contient 4 motifs de fixation du calcium "EF-hands".

Le mécanisme d'activation des CDPK est trés semblable à celui des CaM kinases.

Comme le domaine catalytique des CDPK est hautement homologue de celui des CaM kinases d'animaux (exemple : 44% et 43% d'identité avec, respectivement, la CaM-kinase II α et β de souris), on suppose que les CDPK résultent de la fusion de gènes codant une CaM kinase et une calmoduline.

Les différences de séquences en acides aminés entre les isoformes des CDPK sont principalement observées au niveau de l'extrémité trés variable du domaine N-terminal. Ces différences sont aussi liées à l'existence de nombreux sites de modification post-traductionnelle par des acides gras (myristoylation et palmitoylation) qui servent à ancrer les CDPK dans la membrane.

Spécifité de substrats des CDPK : voir un tableau des cibles potentielles.

L'un des meilleurs motifs consensus de phosphorylation par les CDPK est : [basique-hydrophobe-X-basique]-X(2)-S-X(3)-hydrophobe-basique (où X est n'importe quel acide aminé).

La protéine kinase A (Ser/Thr protéine kinase) est impliquée dans la régulation de la synthèse du glycogène.

Elle est contrôlée par l'AMP cyclique (figure ci-contre) synthétisé par l'adénylate cyclase.

En son absence, la protéine kinase A est sous forme d'un tétramère constitué de deux types de sous-unités (2 sous-unités catalytiques et 2 sous-unités régulatrices - R2C2) :

• les sous-unités régulatrices bloquent le site actif des sous-unités catalytiques
• la fixation de l'AMPc aux sous-unités régulatrices induit leur dissociation du tétramère, libérant ainsi les sous-unités catalytiques actives

La protéine kinase A phosphoryle les protéines sur un résidu Ser ou Thr contenu dans un motif consensus : R-X-X-S/T (X est n'importe quel acide aminé).

Les sous-unités catalytiques de la protéine kinase A peuvent être régulées par phosphorylation.

Mais l'activation de la protéine kinase A est essentiellement contrôlée par un mécanisme de rétro-inhibition :

• en effet, la phosphodiestérase est phosphorylée par la protéine kinase A
• or la phosphodiestérase catalyse la conversion de l'AMPc en AMP réduisant ainsi le taux susceptible d'activer la protéine kinase A

11. Généralités sur les MAP-kinases

Les voies de signalisation qui impliquent la famille des MAP kinases ("Mitogen-activated protein kinases" - MAPK) transforment des stimuli extracellulaires en réponses intracellulaires par le biais d'un grand nombre de types de récepteurs, tels que :

• les récepteurs couplés à des protéines G
• les récepteurs des cytokines
• les récepteurs de facteurs de croissance
• les récepteurs associés à des stress environnementaux

Les MAPK régulent de manière coordonnée la prolifération cellulaire, la différenciation, la mobilité et bien d'autres processus : voir la figure interactive du site Biocarta.

La famille des MAPK contient 4 sous-familles :

• ERK ("Extracellular signal-Regulated Kinase")
• JNK ("c-Jun N-terminal kinase") : 3 isoformes JNK1, JNK2 et JNK3 ("Stress-Activated Protein Kinase" - SAPK-γ, SAPK-α et SAPK-β, respectivement)
• ERK5 ("Extracellular-signal-regulated kinase 5")
• MAP kinases p38

Chaque MAPK possède ses propres activateurs, substrats et inactivateurs :

• elles sont phosphorylées par les (MAP kinase)-kinases (MAPK-K)
• elles phosphorylent diverses cibles, en particulier les protéines kinases activées par les MAP-kinases ("(MAP kinases)-activated protein kinases" - MAPK-APK)
• elles sont déphosphorylées et inactivées par plusieurs (MAP kinases)-phosphatases (MKP)

Mécanisme d'activation des MAP-kinases

a. Interaction d'empilement ("docking interaction")

Des régions appelées domaines ou sites d'empilement ("docking sites" ou "D-sites") médient les interactions protéine - protéine de certaines MAPK.

Les sites d'empilement des MAPK sont de courts segments d'acides aminés, généralement proches de l'extrémité N-terminale.

La séquence consensus des sites d'empilement est : [1 à 4 acides aminés basiques] - [quelques acides aminés "espaceurs"] - [1 acide aminé hydrophobe - X - 1 acide aminé hydrophobe].

Voir : Whisenant et al. (2010)

Source : Ho et al. (2006)

Figure ci-contre : Exemple d'interaction d'empilement via le domaine d'empilement ("CD domain") d'une MAPK de la famille ERK.

• ERK2 : "Extracellular-signal-regulated kinase 2"
• MEK1 : [MAPK/ERK kinase 1] ou MAPK-K1

Presque toutes les protéines qui interagissent avec les MAPK (leurs substrats et les MAPK-K) possèdent un motif conservé ("MAPK-docking site" - figure ci-dessous) responsable de cette interaction avec le domaine d'empilement (voir un article sur l'interaction ERK2 / caspase).

• en haut : position du motif dans le cas des MAPK-K
• au milieu : position du motif dans le cas des MAPK-APK
• en bas : position du motif dans le cas des MKP

Le point important est que ce motif se trouve en dehors du domaine catalytique (kinase ou phosphatase).

L'interaction protéine - protéine des MAPK et de ces molécules n'est donc pas semblable à l'interaction enzyme-substrat "classique" observée au niveau d'un site actif.

b. L'échaffaudage ("scaffolding")

Les protéines d'échaffaudage s'associent simultanément aux différents composants de la voie de signalisation des MAPK.

Exemple : chez la levure, la protéine d'échaffaudage ("scaffold protein") Ste5 possède un site de fixation pour la MAPK-KK (Ste11), un site de fixation pour la MAPK-K (Ste7) et un site de fixation pour la MAPK (Fus3).

La MAPK-KK active la MAPK-K qui à son tour active la MAPK.

De plus, Ste5 change la conformation de la MAPK Fus3, ce qui permet qu'elle soit phosphorylée et activée par la MAPK-K Ste7.

Autre exemple :

• JIP : "JNK-interacting protein"
• MKK7 : MAP kinase kinase 7
• JNK : "c-Jun N-terminal kinase"

Voir : Dhanasekaran et al. (2007)

12. Les MAP kinases p38

Les MAP kinases p38 ("Mitogen-activated protein kinase p38") des mammifères sont activées par de nombreux stress cellulaires (lipopolysaccharides, choc osmotique, exposition aux ultra-violets) mais aussi en réponse à des cytokines liées à l'inflammation.

La sous-famille des MAP kinases p38 contient 4 membres : p38α, p38β, p38γ et p38δ. Elles ont une homologie de séquence d'environ 60%.

Cependant, elles différent quant à :

• leurs profils d'expression
• leurs spécificités de substrat
• leurs sensibilités aux inhibiteurs chimiques tel que le SB203580.

L'activité des MAP kinases p38 est capitale pour une réponse immunitaire et inflammatoire normales : en effet, la voie de signalisation des MAP kinases p38 est un élément clé de la régulation de la biosynthèse des cytokines pro-inflammatoires au niveau transcriptionnel et traductionnel.

En conséquence, nombre de molécules impliquées dans cette voie sont des cibles thérapeutiques pour la mise au moint de médicaments contre certaines maladies auto-immunes et contre l'inflammation.

Des études plus récentes ont montré un rôle plus large encore des MAP kinases p38 puisqu'elles participent au contrôle du cycle cellulaire et du remodelage du cytosquelette.

La MAP-kinase p38 (p38 MAPK dans la figure ci-contre) est activée par phosphorylation de la Thr 180 et de la Tyr 182 par les kinases MKK3 et SEK.

La MAP-kinase p38 ainsi modifiée phosphoryle à son tour et active la MAPK-APK 2 (voir ci-après) qui active un certain nombre de facteurs de transcription dont ATF-2.

Source : "Cell signaling"

La voie des MAP-kinase p38 et les processus auxquelles elles sont liés, impliquent le fonctionnement d'une autre famille de kinases dont on découvre de plus en plus de membres : les protéines kinases activées par les MAP-kinases ("(MAP kinases)-activated protein kinases" - MAPK-APK).

Les MAPK-APK sont des sérine/thréonine kinases.

Elles répondent à des stimuli mitogènes ou des stress via une phosphorylation dirigée par une proline ("proline-directed phosphorylation").

Cette activation du domaine kinase des MAPK-APK est catalysée par des kinases 1 and 2 et des MAP kinases p38 qui sont elles-mê�mes régulées par des signaux extracellulaires.

On compte actuellement 11 MAPK-APK chez les vertébrés, réparties en 5 sous-familles :

• les "ribosomal S6 kinases"
• les "mitogen-activated kinases" et les "stress-activated kinases"
• les "(MAP kinase)-interacting kinases"
• les "(MAP kinase)-activated protein kinases" 2 et 3
• les "(MAP kinase)-activated protein kinases" 5

Elles semblent jouer un rôle important dans :

• la traduction des ARN messagers
• la prolifération cellulaire
• la réponse au niveau du noyau à des agents mitogènes ou des stress cellulaires

Illustration de la régulation de l'expression des gènes de l'inflammation par la MAP-kinase p38 et la MAPK-APK 2 (dénommée MK2 dans la figure ci-contre).

Les ARN messagers qui ont un "turn-over" rapide contiennent souvent des éléments riches en A et U ("AU-rich elements" - ARE) dans la partie 3' non traduite.

Source : Schindler et al. (2007)

13. Modulation de l'activité et de la localisation des facteurs de transcription NFAT ("Nuclear Factor of Activated T cells")

La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :

• en les activant directement (exemple : facteur AP-1)
• en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)

NFAT est une famille de facteurs de transcription :

• NFAT1 (NFATc2 ou NFATp)
• NFAT2 (NFATc1 ou NFATc)
• NFAT3 (NFATc4)
• NFAT4 (NFATc3 ou NFATx)

Le facteur de transcription NFAT3 est impliqué dans la formation des adipocytes et dans la régulation de l'expression du gène PPAR-γ2.

Sa localisation cellulaire dépend de la phosphorylation des sérines en position 168 et 170 par la MAP-kinase p38.

La phosphorylation massive du facteur NFAT par des kinases (telles que GSK-3 ou CK1) le rend inactif et dans ce cas il est localisé dans le cytoplasme.

Un accroissement du taux de calcium intracellulaire active la sérine-phosphatase calcineurine calcium/calmoduline-dépendante qui déphosphoryle NFAT.

Ce dernier est déplacé dans le noyau où il active la transcription des gènes cibles.

Source : "Biochimie des protéines"

La ciclosporine A (polypeptide cyclique lipophile) et FK506 sont des drogues immuno-suppresseurs qui inhibent la calcineurine.

En conséquence, leur action est de confiner les protéines NFAT dans le cytoplasme.

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