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La phosphorylation et les protéines kinases |
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1. La phosphorylation 2. Les familles de protéines kinases 3. Les spécificités de substrat et quelques motifs consensus de phosphorylation 4. La sous-unité calalytique des protéines kinases 5. La déphosphorylation par les protéines Ser/Thr ou Tyr phosphatases 6. Mécanisme d'activation de certaines protéines kinases 7. Exemple de cascade de phosphorylation |
8. Les protéines kinases calcium/calmoduline dépendantes - CaM kinase (animaux) 9. Les protéines kinases calcium dépendantes - CDPK (plantes) 10. La protéine kinase A (voir une animation : activation PKA par l'AMPc) 11. Généralités sur les MAP-kinases 12. Les MAP kinases p38 13. Modulation de l'activité et de la localisation des facteurs de transcription NFAT 14. Liens Internet et références bibliographiques |
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1. La phosphorylation C'est une modification post-traductionnelle des protéines absolument capitale qui intervient dans un trés grand nombre de processus cellulaires (différenciation, division, prolifération, apoptose, ...) et en particulier dans les mécanismes de signalisation. Le processus de phosphorylation est connu depuis plus d'un siècle (Levene & Alsberg, 1906) suivi de la mise en évidence d'une phosphosérine dans la vitelline (Lipmann & Levene, 1932) puis de la première description de la phosphorylation d'une protéine (Burnett G. & Kennedy E.P, 1954). La phosphorylation induit des modifications structurales donc fonctionnelles trés importantes de la protéine cible qui ont pour conséquences (entre autres) :
La phosphorylation est une modification qui est réversée par la déphosphorylation catalysée par les protéines phosphatases. |
| La phosphorylation est la réaction d'estérification de la chaîne latérale de la sérine, de la thréonine ou de la tyrosine (chez les eucaryotes), par addition d'un ou plusieurs groupement(s) phosphate. |
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Le taux de phosphorylation de la sérine, de la thréonine ou de la tyrosine est respectivement de 1000 / 100 / 1. Bien que quantitativement moins importante, la phosphorylation de la tyrosine a une incidence biologique importante. Par exemple, l'activité d'un grand nombre de facteur de croissance est contrôlée par la phosphorylation de cet acide aminé. |
| 2. Les familles de protéines kinases |
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Les 27 familles de protéines kinases constituent l'une des plus vastes et importantes super-familles de protéines. Elles représentent environ 2% des gènes dans bon nombre de génomes d'eucaryotes. Elles interviennent dans la régulation de la plupart de toutes les voies métaboliques et semblent phosphoryler environ 30% du protéome !
[Rappel : EC 2 = transférases - EC 2.7 = transfert de groupe contenant un phosphore]. Elles catalysent les réactions de phosphorylation. |
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les protéines tyrosine kinases |
les protéines sérine / thréonine kinases (EC 2.7.11.1) |
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Plus de 90 protéines tyrosine kinases sont recencées dans le génome humain et forment une trés vaste famille multigènique. Les protéines tyrosine kinases sont divisés en 2 groupes : a. les protéines tyrosine kinases cytoplasmiques (32 de ce type - EC 2.7.10.2). b. les protéines tyrosine kinases récepteurs transmembranaires ("transmembrane receptor-linked kinases" - 58 de ce type / EC 2.7.10.1 - EC 2.7.1.112). Exemple : le récepteur de l'insuline. Elles sont constituées d'un domaine extracellulaire qui fixe un ligand spécifique, d'un domaine transmembranaire et d'un domaine catalytique intracellulaire qui fixe et phosphoryle les protéines cibles. La fixation du ligand au domaine extracellulaire entraîne des modifications structurales des protéines tyrosine kinases, ce qui les activent. |
Quelques exemples :
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les protéines histidine kinases (EC 2.7.13.3) Elle n'ont pas de point commun du point de vue structural avec les autres protéines kinases et sont trouvées essentiellement chez les procaryotes et les plantes. Elles fonctionnent en "relai" avec un résidu aspartate qui reçoit le groupement phosphoryle préalablement transféré de l'ATP sur l'histidine. |
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Différences avec Arabidopsis thaliana (plantes) Le génome de Arabidopsis thaliana code pour environ 1100 protéines kinases, soit 4% des 25 500 gènes prédits. Cette proportion est donc le double de celle observée chez l'homme, chez Saccharomyces cerevisiae ou chez Caenorhabditis elegans. Chez Arabidopsis thaliana, les protéines kinases récepteurs transmembranaires phosphorylent les résidus Ser et Thr (elles phosphorylent essentiellement les Tyr chez les animaux - voir ci-dessus). Les deux principaux types de kinases qui médient le signal calcique chez les animaux, les protéines kinases calcium / calmoduline dépendantes (CaM kinase) et la protéine kinase C, semblent absentes ou sous-représentées chez Arabidopsis thaliana. |
| 3. Les spécificités de substrat et quelques motifs consensus de phosphorylation |
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Des analyses statistiques des séquences primaires d'un trés grand nombres de substrats de protéines kinases ont montré que les 4 acides aminés (au moins) en amont et en aval du site phospho-accepteur ont une influence sur la sélection du substrat par les protéines kinases. Les caractéristiques physico-chimiques des chaînes latérales de ces 8 acides aminés indiquent que : a. les protéines sérine / thréonine kinases peuvent être schématiquement classées en 3 catégories :
b. les protéines tyrosine kinases sont davantage acidophiles |
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Exemples de motifs consensus de phosphorylation (Schwartz & Gygi, 2005) |
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sérine kinases |
thréonine kinases |
tyrosine kinases |
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RXRXXSP (cas général) |
TPP T180[EPG]Y182 (MAP kinases - double phosphorylation) |
EXXY |
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S/TPX[KR] (kinases cycline dépendantes) |
Y[DS] |
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S/TDX[DE] (caséine kinase II) |
YXXP |
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| 4. La sous-unité calalytique des protéines kinases |
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La sous-unité catalytique des protéines kinases (qu'elles soit Tyr ou Ser / Thr) est extrêmement conservée du point de vue structural, ce qui permet de mettre au point un grand nombre d'inhibiteurs dans le but de traiter des maladies. 510 séquences de protéines kinases de l'homme ont été comparées et fournissent les données suivantes (Source : Kostich et al., 2002) :
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Superposition des sites de fixation de l'ATP et du magnésium (magenta) de la MAP-kinase p38 (jaune) et de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (rouge). Source : Wilson et al. (1996) |
Boucle catalytique et boucle d'activation de la protéine kinase A. Trois résidus catalytiques sont mis en évidence : D166, K168 et N171. Source : Kornev et al. (2008)
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De tous les motifs, c'est le motif riche en Gly qui est le plus variable entre les séquences de protéines kinases. Les autres sont conservés à 95%. Remarque : la numérotation des acides aminés pour chaque sous-domaine mentionnée ci-dessus est celle de la sous-unité catalytique de la protéine kinase A. |
| 5. La déphosphorylation par les protéines Ser/Thr ou Tyr phosphatases |
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La phosphorylation est le plus souvent transitoire. Le ou les groupement(s) ajoutés sont ensuite clivés : la déphosphorylation est catalysée par les protéines phosphatases. La plupart des protéines kinases ont une phosphatase qui leur est associée. La phosphorylation - déphosphorylation est donc :
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Sur la base de leur homologie de séquences en acides aminés, de leurs structures 3D et de leurs sensibilités aux inhibiteurs, les protéines phosphatases sont classées en 4 familles :
Bien qu'il y ait peu d'homologie entre les séquences en acides aminés des protéines Ser phosphatases et des protéines Thr phosphatases, la structure de leur domaine catalytique est similaire. Elle est en revanche trés différente de celle des protéines Tyr phosphatases. |
Voir des structures des kinases et d'une tyrosine phosphatase |
Figure ci-contre, les 3 familles de protéines Ser/Thr phosphatases.
Les séquences des motifs signature sont indiqués au dessus des diagrammes. Les domaines catalytiques de chaque protéine sont indiqués en dessous des diagrammes. Les acides aminés impliqués dans la coordination au métal et dans la fixation du phosphate sont colorés en rouge et en bleu, respectivement. La famille PPP contient 3 motifs caractéristiques au sein du domaine catalytique conservé : GDxHG, GDxVDRG, et GNHE. Il en va de même pour la famille PPM. |
Source : Shi Y. (2009)
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Légende de la figure ci-dessus : toutes les protéines sont d'origine humaine sauf PP7 (Arabidopsis thaliana).
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Différentes phosphatases et leur nomenclature :
A l'exception de PP2B et PP2C, elles sont inhibées spécifiquement par les microcystines (famille de toxines peptidiques cyclique des cyanobactéries). |
Les protéines Ser/Thr phosphatases de type 1 (PP1) sont des phosphatase majeures et ubiquitaires dans toutes les cellules eucaryotes. Chaque PP1 est constituée d'une sous-unité catalytique et d'une sous-unité régulatrice (R). Les séquences des sous-unités catalytiques sont très conservées au sein des eucaryotes (environ 70% ou plus d'identité de séquences). Elles ont une structure 3D conservée. Plus de 100 sous-unités régulatrices R ont été identifiées. L'analyse des sous-unités R d'un grand nombre d'eucaryotes suggère un accroissement du nombre de sous-unités R concomitant avec l'évolution des organismes multicellulaires. Les sous-unités R pourraient adresser la sous-unité catalytique à des compartiments cellulaires spécifiques, moduler la spécificité de substrat ou même servir de substrat elles-mêmes. Les associations in vivo des sous-unités catalytiques de PP1 (ou de PP2A) avec différentes sous-unités R génèrent un vaste ensemble de protéines appelées holoenzymes. Ces holoenzymes sont différentiellement exprimées. En conséquence, les interactions entre ces deux types de sous-unités sont capitales pour les trés nombreux processus cellulaires dans lesquels les PP1 sont impliquées : le métabolisme, la réplication et la transcription de l'ADN, l'épissage des ARN et leur traduction, la meïose et la division cellulaire, l'apoptose, la synthèse des protéines, la réorganisation du cytosquelette, le métabolisme, la régulation des récepteurs membranaires et des canaux. |
Partie A de la figure ci-contre :
Partie B de la figure ci-contre :
Partie C de la figure ci-contre : structure du domaine catalytique de PP1 (en bleu) lié à la sous-unité régulatrice de la protéine d'adressage de la phosphatase de la myosine (MYPT1 - en vert). 3 motifs de MYPT1 sont impliqués dans les interactions :
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Source : Shi Y. (2009)
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| Dans le cas des protéines
kinases AMPc dépendantes, les sous-unités régulatrices
(et donc le domaine pseudo-substrat) sont distinctes des sous-unités
catalytiques.
Dans le cas des protéines kinases calcium / calmoduline dépendantes et de la protéine kinase C, le domaine pseudo-substrat fait partie de la chaîne polypeptidique globale qui constitue la kinase. |
Source : "ADN recombinant" Watson et al. (1994) - Ed. DeBoeck - ISBN 2-8041-1597-6 |
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Dans chacun des cas, la fixation des ligands qui activent ces kinases induit un changement de structure qui dissocie le domaine pseudo-substrat du site catalytique. Ces ligands sont respectivement :
Les protéines tyrosine kinases peuvent s'autophosphoryler au niveau du segment d'activation de leur domaine kinase. Ce processus induit un changement de conformation qui les active. Exemples de domaines de fixation dépendants de la phosphorylation : "Src homology 2" (SH2), "phosphotyrosine binding" (PTB), "BRCA1 C-terminal" (BRCT), protéine 14-3-3. |
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7. Exemple de cascade de phosphorylation : la glycogènolyse |
Un exemple type de protéines
phosphorylées est :
des cellules hépatiques en réponse au relarguage du glucagon du pancreas. La phosphorylation :
Ces deux évènements ont pour conséquence une augmentation du taux de glucose hépatique dans le sang. |
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8. Les protéines kinases calcium/calmoduline dépendantes - CaM kinase (animaux) Quand la calmoduline a fixé 4 ions calcium, elle adopte une nouvelle conformation qui lui permet d'interagir avec d'autres protéines cibles afin de les activer. En particulier, la kinase II calcium/calmoduline-dépendante ou CaM-kinase II (EC 2.7.1.123) :
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La CaM kinase II possède :
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a. La fixation de la calmoduline, compléxée au calcium, au domaine de régulation de la CaM-kinase II lève le pouvoir auto-inhibiteur de ce domaine et active le domaine catalytique. b. La CaM-kinase II ainsi activée s'autophosphoryle sur la thréonine 286. c. Une diminution du taux de Ca2+ entraîne une dissociation de la calmoduline de la CaM-kinase II, cette dernière demeurant active. d. L'hydrolyse du groupement phosphate du domaine auto-inhibiteur par la protéine phosphatase 1 inactive de nouveau la CaM-kinase II. e. La protéine kinase A régule l'activité déphosphorylante de la protéine phosphatase 1. |
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| L'un des meilleurs motifs consensus de phosphorylation par les CaM-kinases est : [basique-basique-X-basique]-hydrophobe-X(4)-S/T-X-basique (où X est n'importe quel acide aminé). |
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9. Les protéines kinases calcium dépendantes - CDPK (plantes) Chez les plantes et les protozoaires, les protéines kinases calcium dépendantes (" Calcium-dependent protein kinases" - CDPK - EC 2.7.11.1) médient le signal calcique. Il semble que le génome de Arabidopsis thaliana contient 34 gènes codant cette enzyme. Ce sont des des sérine/thréonine kinases. Exemple : MM CDPK riz = 56,7 kDa / 514 acides aminés / pI = 5,18 |
La structure des CDPK
est différente
de celle des CaM kinases. En
effet, les CDPK
possèdent (figure ci-contre):
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| En conséquence, les CDPK sont activées directement par le calcium sans l'intervention de calmoduline exogène. |
| Les CDPK ont une structure hautement conservée. Le mécanisme d'activation des CDPK est trés semblable à celui des CaM kinases. Comme le domaine catalytique des CDPK est hautement homologue de celui des CaM kinases d'animaux (exemple : 44% et 43% d'identité avec, respectivement, la CaM-kinase II α et β de souris), on suppose que les CDPK résultent de la fusion de gènes codant une CaM kinase et une calmoduline. Les différences de séquences en acides aminés entre les isoformes des CDPK sont principalement observées au niveau de l'extrémité trés variable du domaine N-terminal. Ces différences sont aussi liées à l'existence de nombreux sites de modification post-traductionnelle par des acides gras (myristoylation et palmitoylation) qui servent à ancrer les CDPK dans la membrane. Spécifité de substrats des CDPK : voir un tableau des cibles potentielles. L'un des meilleurs motifs consensus de phosphorylation par les CDPK est : [basique-hydrophobe-X-basique]-X(2)-S-X(3)-hydrophobe-basique (où X est n'importe quel acide aminé). |
| 10. La protéine kinase A (voir une animation : activation PKA par l'AMPc) |
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La protéine kinase A est impliquée dans la régulation de la synthèse du glycogène. Elle est contrôlée par l'AMP cyclique (figure ci-contre) synthétisé par l'adénylate cyclase. En son absence, la protéine kinase A est sous forme d'un tétramère constitué de deux types de sous-unités (2 sous-unités catalytiques et 2 sous-unités régulatrices - R2C2) :
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La protéine kinase A phosphoryle les protéines sur un résidu Ser ou Thr contenu dans un motif consensus : R-X-X-S/T (X est n'importe quel acide aminé). Les sous-unités catalytiques de la protéine kinase A peuvent être régulées par phosphorylation mais l'activation de la protéine kinase A est essentiellement contrôlée par un mécanisme de rétro-inhibition :
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| 11. Généralités sur les MAP-kinases |
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Les voies de signalisation qui impliquent la famille des MAP kinases ("Mitogen-activated protein kinases" - MAPK) transforment des stimuli extracellulaires en réponses intracellulaires par le biais d'un grand nombre de types de récepteurs, tels que :
Les MAP kinases régulent de manière coordonnée la prolifération cellulaire, la différenciation, la mobilité, ... Chaque MAP kinase possède ses propres activateurs, substrats et inactivateurs.
La famille des MAP kinases contient 4 sous-familles :
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Premier mécanisme qui semble réguler le mode de fonctionnement des MAP-kinases : l'interaction d'empilement ("docking interaction"). Des régions appelées sites d'empilement ("docking sites" ou "D-sites") médient les interactions protéine - protéine dans le cas des MAPK. Les sites d'empilement des MAP-kinases sont de courts segments d'acides aminés que possèdent les MAP-kinases mais aussi les protéines qui interagissent avec elles (c'est-à-dire leurs substrats et les MAPK-kinases). Dans tous les cas les sites d'empilement se trouvent proches de l'extrémité N-terminale. Source : Ho et al. (2006) |
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L'interaction d'empilement s'établit via le domaine d'empilement ("CD domain") des MAP kinases (figure de gauche).
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Presque toutes les protéines qui interagissent avec les MAP kinases possèdent un motif conservé ("MAPK-docking site" - figure ci-dessous) responsable de cette interaction avec le domaine d'empilement (voir un article sur l'interaction ERK2 / caspase). Le point important est que ce motif se trouve en dehors du domaine catalytique (kinase ou phosphatase). L'interaction entre les MAP kinases et ces molécules n'est donc pas semblable à l'interaction enzyme-substrat "classique" observée au niveau d'un site actif.
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Deuxième mécanisme qui semble réguler le mode de fonctionnement des MAP kinases : l'échaffaudage ("scaffolding"), mécanisme qui en général met en jeu une 3ème molécule. Les protéines d'échaffaudage s'associent simultanément aux différents composants de la voie de signalisation des MAP kinases.
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| 12. Les MAP kinases p38 |
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Les MAP kinases p38 ("Mitogen-activated protein kinase p38") des mammifères sont activées par de nombreux stress cellulaires (lipopolysaccharides, choc osmotique, exposition aux ultra-violets) mais aussi en réponse à des cytokines liées à l'inflammation. La sous-famille des MAP kinases p38 contient 4 membres : p38α, p38β, p38γ et p38δ. Elles ont une homologie de séquence d'environ 60%. Cependant, elles différent quant à :
L'activité des MAP kinases p38 est capitale pour une réponse immunitaire et inflammatoire normales : en effet, la voie de signalisation des MAP kinases p38 est un élément clé de la régulation de la biosynthèse des cytokines pro-inflammatoires au niveau transcriptionnel et traductionnel. En conséquence, nombre de molécules impliquées dans cette voie sont des cibles thérapeutiques pour la mise au moint de médicaments contre certaines maladies auto-immunes et contre l'inflammation. Des études plus récentes ont montré un rôle plus large encore des MAP kinases p38 puisqu'elles participe au contrôle du cycle cellulaire et du remodelage du cytosquelette. |
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La MAP-kinase p38 (p38 MAPK dans la figure ci-contre) est activée par phosphorylation de la Thr 180 et de la Tyr 182 par les kinases MKK3 et SEK. La MAP-kinase p38 ainsi modifiée phosphoryle à son tour et active la MAPK-APK 2 (voir ci-après) qui active un certain nombre de facteurs de transcription dont ATF-2. Source : "Cell signaling" |
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La voie des MAP-kinase p38 et les processus auxquelles elles sont liés, impliquent le fonctionnement d'une autre famille de kinases dont on découvre de plus en plus de membres : les protéines kinases activées par les MAP-kinases ("(MAP kinases)-activated protein kinases" - MAPK-APK). Les MAPK-APK sont des sérine/thréonine kinases. Elles répondent à des stimuli mitogènes ou des stress via une phosphorylation dirigée par une proline ("proline-directed phosphorylation"). Cette activation du domaine kinase des MAPK-APK est catalysée par des kinases 1 and 2 et des MAP kinases p38 qui sont elles-mêmes régulées par des signaux extracellulaires. On compte actuellement 11 MAPK-APK chez les vertébrés, réparties en 5 sous-familles :
Elles semblent jouer un rôle important dans :
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Illustration de la régulation de l'expression des gènes de l'inflammation par la MAP-kinase p38 et la MAPK-APK 2 (dénommée MK2 dans la figure ci-contre). Les ARN messagers qui ont un "turn-over" rapide contiennent souvent des éléments riches en A et U ("AU-rich elements" - ARE) dans la partie 3' non traduite. Source : Schindler et al. (2007) |
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Sa localisation cellulaire dépend de la phosphorylation des sérines en position 168 et 170 par la MAP-kinase p38. La phosphorylation massive du facteur NFAT par des kinases (telles que GSK-3 ou CK1) le rend inactif et dans ce cas il est localisé dans le cytoplasme. Un accroissement du taux de calcium intracellulaire active la sérine-phosphatase calcineurine calcium/calmoduline-dépendante qui déphosphoryle NFAT. Ce dernier est déplacé dans le noyau où il active la transcription des gènes cibles. |
Source : "Biochimie des protéines" |
La ciclosporine A (polypeptide cyclique lipophile) et FK506 sont des drogues immuno-suppresseurs qui inhibent la calcineurine. En conséquence, leur action est de confiner les protéines NFAT dans le cytoplasme. |
| 14. Liens Internet et références bibliographiques |
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Levene P.A. & Alsberg C.L. (1906) "The cleavage products of vitellin" J. Biol. Chem. 2, 127 - 133 Lipmann F.A. & Levene P.A. (1932) "Serinephosphoric acid obtained on hydrolysis of vitellinic acid" J. Biol. Chem. 98, 109 - 114 Burnett G. & Kennedy E.P (1954) "The enzymatic phosphorylation of proteins" J. Biol. Chem. 211 , 969 - 980 Tanoue T. & Nishida E. (2003) "Molecular recognitions in the MAP kinase cascades" Cell. Signalling 15, 455 - 462 |
|
| Schwartz, D. & Gygi, S.P. (2005) "An iterative statistical approach to the identification of protein phosphorylation motifs from large-scale data sets" Nature Biotechnol. 23, 1391 - 1398 | |
| Logiciel
de prédiction en ligne : "pkaPS - Prediction of protein
kinase A phosphorylation sites using the simplified kinase binding model"
Neuberger et al. (2007) "pkaPS: prediction of protein kinase A phosphorylation sites with the simplified kinase-substrate binding model" Biol Direct. 2, 1 |
|
| "Cell Signaling" : signalisation de voies métaboliques | |
| "MPR: Mammalian Phosphorylation Resource" NCI, Bethesda | |
|
"Phospho.ELM" : a database of experimentally verified phosphorylation sites in eukaryotic proteins. |
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|
Kuhn et al. (2007) "Functional Classification of Protein Kinase Binding Sites Using Cavbase" ChemMedChem 2, 1432 - 1447 |
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Kostich et al. (2002) "Human members of the eukaryotic protein kinase family" Genome Biology 3, research0043.1 Wilson et al. (1996) "Crystal Structure of p38 Mitogen-activated Protein Kinase" J. Biol. Chem. 271, 27696 - 27700 Ho et al. (2006) "Interacting JNK-docking Sites in MKK7 Promote Binding and Activation of JNK Mitogen-activated Protein Kinases" J. Biol. Chem. 281, 13169 - 13179 Kornev et al. (2008) "A helix scaffold for the assembly of active protein kinases" PNAS 105, 14377 - 14382 Won et al. (2011) "Recruitment interactions can override catalytic interactions in determining the functional identity of a protein kinase" PNAS 108, 9809 - 9814 |
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| Cheng et al. (2002) "Calcium Signaling through Protein Kinases. The Arabidopsis Calcium-Dependent Protein Kinase Gene Family" Plant Physiol. 129, 469 - 485 | |
Schindler et al. (2007) "p38 Pathway Kinases as Anti-inflammatory Drug Targets" J. Dent. Res. 86, 800 - 811 Shi Y. (2009) "Serine/threonine phosphatases: mechanism through structure" Cell 139, 468 - 484 |
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