Les réactions enzymatiques à 2 substrats : hypothèse du quasi-équilibre

1. Introduction et définitions

2a. Système au hasard

2b. Démarche expérimentale pour la détermination des vitesses initiales

3. Système ordonné

4. Système à double déplacement ("ping - pong")

1. Introduction et définitions

Dans le cadre de ce cours, nous ferons l'hypothèse de l'établissement rapide des différents équilibres de fixation entre l'enzyme et les substrats :

• en d'autres termes, nous retiendrons l'hypothèse du quasi-équilibre (l'étape de catalyse étant l'étape limitante). L'approche du quasi-équilibre est plus simple pour l'établissement de l'équation de la vitesse.

• par ailleurs, elle est justifiée pour les systèmes appelés "au hasard" et, dans une moindre mesure, pour ceux appelés "ordonnés".

• cependant, cette approche nécessite une méthode graphique qui permet de représenter la distribution des différents complexes enzymatiques en termes de concentration de substrat et des différentes constantes de vitesse : la méthode de E. King & C. Altman (1956).

• de plus, l'équation de la vitesse ainsi obtenue n'est pas encore utilisable telle quelle tant que les constantes de vitesse n'ont pas été exprimées en termes de paramètres cinétiques déterminables expérimentalement (V_M, K_M et K_I). Il faut alors appliquer les règles générales (ou nomenclatures) développées par W. Cleland (1963).

• on appellera A et B les SUBSTRATS d'une réaction ;
• on appellera P et Q les PRODUITS d'une réaction ;
• on appellera E et E' les différentes formes de l'enzyme pour les systèmes impliquant une isomérisation de celle - ci.

• toute forme sous laquelle se trouve l'enzyme (libre, complexée au(x) substrat(s) ; complexée au(x) produit(s) ; ...) ;
• toute forme qui ne peut pas se dissocier selon une réaction unimoléculaire (ou s'isomériser dans une telle forme) est appelée forme enzymatique stable.

• complexe entre l'enzyme ET TOUS les substrats OU complexe entre l'enzyme ET TOUS les produits ;
• exemple : dans la réaction EAB <==> E +P, EAB est un complexe central ;
• le nombre minimal de complexes centraux est donc 2 ; un tel complexe ne participe qu'à des réactions unimoléculaire (relarguage d'un substrat ou d'un produit) ;
• exception : dans les systèmes à double déplacement ("ping - pong"), il n'existe pas de complexe (enzyme - tous les substrats) ou de complexe (enzyme - tous les produits).

• complexe enzyme - ligand (substrat ou produit) qui ne participe pas à la formation de produit(s) de la réaction ;
• une partie de l'enzyme est donc inactive et le ligand est considéré comme un inhibiteur.

• système où TOUS les substrats doivent se fixer à l'enzyme AVANT que n'importe lequel des produits ne soit relargué ;
• exemple : système au hasard ou système ordonné.

• système où un PRODUIT est relargué ENTRE les additions successives des substrats ;
• exemple : système à double déplacement ("ping - pong").

• système proposé par H. Theorell & B. Chance (1951) pour un mécanisme ordonné SANS complexe central (le premier produit est relargué par la fixation du dernier substrat)).

• Bi Bi : système impliquant 2 substrats et 2 produits ; exemple : Bi Bi au hasard ;
• Bi Uni (ou Uni Bi) : système impliquant 2 substrats et 1 produit (ou l'inverse); exemple : Bi Bi ordonné ;
• Iso : système impliquant une isomérisation de l'enzyme (changement de conformation E <=> E'); exemple : Iso ping - pong ; 

• modèles différents qui fournissent des équations de vitesse formellement identiques.
• exemple : le système Bi Bi au hasard analysé avec l'hypothèse du quasi - équilibre et le système Bi Bi ordonné analysé avec l'hypothèse de l'état stationnaire conduisent à la même expression de la vitesse de la réaction.

• toute réaction élémentaire ne peut être que mono- ou bimoléculaire.
• en d'autres termes, deux molécules de substrats ne peuvent pas se fixer simultanément (les complexes ternaires, quaternaires ... ne peuvent être formés que par additions successives de ligand).

• lorsqu'une réaction élémentaire est bimoléculaire, la réaction réverse est monomoléculaire. On ne peut donc pas avoir de réaction du type :

2. Système au hasard

• deux substrats, A et B, se fixent de manière ALÉATOIRE sur l'enzyme libre E (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de fixation privilégiée de l'un ou l'autre des deux substrats) avec une constante de dissociation K_A et K_B, respectivement ; 

• parfois la fixation de l'un des deux substrats modifie la constante d'équilibre de dissociation de l'autre substrat de l'enzyme libre d'un facteur a ;

Le mécanisme réactionnel s'écrit:	E    +    A          +          B	KA <====>	EA             +             B
	KB	.	aKB
	EB    +    A	aKA <====>	EAB	kcat -------->	E + Produit(s)

2. Pour chaque concentration de A et de B,

la vitesse maximale apparente vaut :

3. Pour chaque concentration de B,

la constante de Michaelis apparente pour le substrat A vaut :

K_A^{app      ------>}      a K_A

4. Pour chaque concentration de A,

la constante de Michaelis apparente pour le substrat B vaut :

Et à concentration SATURANTE en A et B :

K_B^app      ----->      a K_B

Les paramètres : a, K_A et K_B sont déterminés à partir :

• du graphe PRIMAIRE pour le substrat A

• du graphe PRIMAIRE pour le substrat B

Ces valeurs sont reportées dans le graphe SECONDAIRE pour le substrat A et le graphe SECONDAIRE pour le substrat B.

Elles permettent de déterminer : V_M, K_M^A et K_M^B