1. L'enregistrement de la cinétique de la réaction enzymatique

2. Vitesse d'apparition du produit

3. La mesure de la vitesse initiale de la réaction enzymatique

4. Conditions de concentrations en substrat pour les mesures de cinétiques enzymatiques : [S₀] >> [E₀]

5. L'hypothèse du quasi équilibre : l'équation de Henri, Michaelis et Menten, appelée équation de Michaelis - Menten (1913) 

6. L'hypothèse de l'état stationnaire de la concentration du complexe ES : l'équation de Briggs - Haldane (1925)

7. La signification des paramètres cinétiques :
     a. La constante de vitesse k₂ ou constante catalytique k_cat
     b. La vitesse maximale de la réaction V_max
     c. La constante de dissociation K_S et la constante de Michaelis K_M
     d. Le rapport (k_cat / K_M) ou constante de spécificité 

8. La représentation des doubles inverse ou représentation de Lineweaver - Burk

L'enzymologie est une discipline qui paraît bien souvent théorique et, en effet, des modèles ont besoin d'être développés pour rendre compte de la diversité et, parfois, de la complexité des réactions enzymatiques.

Cependant, si l'on manipule des équations, celles-ci s'appliquent à l'analyse de données expérimentales : les valeurs des vitesses d'une réaction enzymatique mesurées dans diverses conditions (de concentrations de substrat, en présence de molécules qui augmentent ou diminuent la vitesse ...).

La cinétique d'une réaction enzymatique est la variation en fonction du temps de la quantité (donc de la concentration) de molécules (substrats et produits de la réaction).

L'enregistrement de cette cinétique implique que cette molécule possède des propriétés physico-chimiques qui permettent de la détecter de manière quantitative :

• mesure de l'absorbance (via la relation de Beer-Lambert)
• mesure de l'émission de fluorescence
• comptage du nombre de désintégrations après marquage radioactif ...

• la fixation du substrat sur l'enzyme libre
• la formation du complexe ES non covalent (complexe de Michaelis - Menten).
• la formation du produit P avec relarguage de l'enzyme libre. 

Par définition la vitesse de la réaction est la variation de la concentration du substrat ou celle du produit en fonction du temps.

Le signe moins indique que l'entité disparaît.

Au début de la réaction enzymatique, il n'y a que le substrat et pas de produit.

Il est préférable, du point de vue de la précision, de mesurer la vitesse d'apparition du produit que celle de la disparition du substrat.

En d'autres termes, on mesure plus précisément une faible augmentation de la concentration du produit (puisque l'on part de zéro), qu'une faible diminution de la concentration du substrat (qui est "énorme" au début de la réaction).

3. La mesure de la vitesse initiale de la réaction enzymatique

Cette équation différentielle n'est pas facile à résoudre et, de plus, rappelons que Henri, Michaelis et Menten ont développé leur théorie à une époque (1913) où l'on ne disposait pas d'ordinateur susceptible d'approcher les solutions d'une manière ou d'une autre.

Pour simplifier l'équation globale, il est nécessaire de faire une première approximation (tout à fait justifiée) : on considère qu'il existe un temps suffisamment court pendant lequel la quantité (donc la concentration) du produit formé est négligeable.

Remarque : négligeable ne signifie pas nulle, sinon on n'aurait aucun signal détécté pour enregistrer la cinétique.

Expérimentalement comment celà se traduit-il ?

On trace la tangente de la cinétique, à partir de son origine, cette tangente correspondant à la "portion linéaire" de la cinétique. Cette estimation visuelle dépend de l'expérimentateur.

La pente de la tangente à l'origine de la cinétique (d[P] / dt) s'appelle la vitesse initiale de la réaction enzymatique, v_i.

Puisque le terme [P] est négligeable, le terme (k_-2 . [E] [P]) l'est aussi.

Remarque : celà ne signifie pas que la constante de vitesse k_-2 est nulle ou négligeable (on ne sait rien à priori sur sa valeur).

4. Conditions de concentrations en substrat pour les mesures de cinétiques enzymatiques : [S₀] >> [E₀]

Une condition supplémentaire pour aboutir à l'équation de Henri, Michaelis et Menten est d'effectuer des mesures de cinétiques avec une concentration initiale du substrat [S₀] beaucoup plus grande que la concentration initiale de l'enzyme [E₀] et ce, pour toutes les concentrations en substrat étudiées.

Ainsi, avant la réaction enzymatique, le milieu réactionnel contient une concentration initiale connue de substrat [S₀] et on déclanche la réaction en ajoutant l'enzyme à une concentration initiale connue [E₀].

Mais dès l'addition de l'enzyme, le milieu réactionnel contient :

• l'enzyme libre (qui n'a pas réagit avec le substrat) à une concentration inconnue [E]
• le substrat libre à une concentration inconnue [S]
• le complexe enzyme - substrat à une concentration inconnue [ES]
• et le produit dont la concentration [P] (déterminée à tous moments) est négligeable puisque l'on enregistre la cinétique en condition de vitesse initiale

5. L'hypothèse du quasi équilibre : l'équation de Henri, Michaelis et Menten, appelée équation de Michaelis - Menten (1913)

Voir une traduction de leur article original (1913)

Maud Menten (1879 - 1960)

Leonor Michaelis (1875 1949)

        [E₀] 
-------------------
             [S₀] 
( 1  +  -------- )
              K_S

Quand la concentration initiale du substrat est très grande, c'est-à-dire quand [S₀] >> K_S, le terme

(asymptote de l'hyperbole) 

Ils ont montré qu'il ne s'établit pas forcément un équilibre rapide pour toutes les enzymes entre les formes libres de l'enzyme et du substrat (E et S) et le complexe enzyme-substrat (ES).

Mais, après un certain délai (appelé état pré-stationnaire), c'est la concentration du complexe enzyme-substrat ES qui demeure constante : cette concentration est à l'état stationnaire.

Celà signifie que si [ES] = constante, les vitesses globales :

• de formation du complexe ES à partir du substrat ET à partir du produit :                          (k₁ . [E] . [S₀]) + (k_-2 . [E] [P])

• de disparition du complexe ES pour reformer le substrat OU former le produit :                (k_-1 . [ES]) + (k₂ . [ES])

sont égales.

(asymptote de l'hyperbole) 

a. La constante de vitesse k₂ ou constante catalytique k_cat

k₂ est une constante de vitesse du premier ordre (réaction monomoléculaire) dont l'unité est : s^-1.

C'est donc l'inverse d'un temps ou une fréquence : la fréquence à laquelle l'enzyme accomplit l'acte catalytique (ou "turn-over").

C'est la raison pour laquelle cette constante est appelée constante catalytique ou k_cat.

b. La vitesse maximale de la réaction V_max

La vitesse maximale d'une réaction enzymatique est une vitesse initiale théorique : c'est l'asymptote de l'hyperbole obtenue lorsque l'on reporte : v_i = f([S₀]), que l'on appelle la courbe de saturation.

Elle ne peut donc être physiquement mesurée puisqu'elle correspond à une concentration de substrat infinie. Sa valeur ne peut-être qu'approchée :

• dans un premier temps par la mesure d'activité en présence de concentrations très grandes de substrat ([S₀] >> K_M).
• dans un second temps, par extrapolation des donnéees expérimentales à une concentration infinie à l'aide de représentations graphiques comme celle, par exemple, dite des double inverse ou représentation de Lineweaver & Burk. Il existe d'autres représentations qui permettent de tracer une droite au lieu d'une hyperbole.

Remarque 1 : Pourquoi appelle-t-on la courbe v_i = f([S₀]), une courbe de saturation ?

Plus la concentration initiale du substrat est élevée, plus il y a de molécules d'enzyme qui fixent une molécule de substrat (plus la concentration du complexe ES est élevée) : on dit que l'enzyme est saturée par le substrat.

Il faut noter que, quelle que soit la concentration du substrat : [S₀] >> [E₀]. En conséqeunce, même si elle n'est pas saturante, la concentration du substrat est toujours en excès.

Remarque 2 : V_max peut être calculée à l'aide de la relation : V_max = k_cat . [E₀].

Cependant, il faut connaître k_cat qui ne peut-être déterminée que si l'on a estimé une valeur la plus approchée de ...V_max !

c. La constante de dissociation K_S et la constante de Michaelis K_M

L'affinité est l'aptitude qu'ont deux molécules à s'associer et K_S est une constante de dissociation donc l'inverse d'une constante d'association.

En conséquence, K_S traduit véritablement l'affinité d'une enzyme pour un substrat.

Voir un complément sur le quasi-équilibre

Quelle est la signification de K_M ?

• k_-1 et k_cat sont des constantes de vitesse du premier ordre (réaction monomoléculaire) dont l'unité est : s^-1
• k₁ est une constante de vitesse du second ordre (réaction bimoléculaire) dont les unités sont : [mol . L^-1 . s^-1] ou [M . s^-1] 
• En conséquence, les unités de K_M sont : ( s^-1 + s^-1 ) / ( M . s^-1 ) = ( s^-1 ) / ( M . s^-1 ) = M

K_M est donc la concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale mesurée est égale à la moitié de la vitesse initiale maximale, V_max.

Voir un complément sur l'état pré - stationnaire

d. Le rapport (k_cat / K_M) ou constante de spécificité

1er cas : une enzyme qui fixerait facilement un substrat (K_M faible) pourrait catalyser très lentement la réaction (k_cat faible).

2ème cas : inversement, une enzyme qui ne serait saturée qu'à de fortes concentrations de substrat (K_M élevé) pourrait accomplir trés rapidement l'acte catalytique (k_cat élevée).

On voit donc que l'un ou l'autre de ces deux paramètres ne permettent pas de caractériser l'efficacité d'une enzyme. Il faut à la fois une fixation du substrat à de faibles concentrations et une catalyse rapide : c'est donc le rapport (k_cat / K_M) qui reflète l'efficacité d'une enzyme à catalyser une réaction.

La limite du rapport (k_cat / K_M) est donc la constante de vitesse d'association enzyme - substrat, k₁.

Cette constante a elle-même pour limite la vitesse de diffusion des macromolécules dans le milieu réactionnel (10⁸ - 10⁹ M . s^-1). 

C'est le cas, par exemple, de la triose phosphate isomérase de la glycolyse.

8. La représentation des doubles inverse ou représentation de Lineweaver-Burk

Le principe des représentations graphiques est de transformer l'équation de Briggs - Haldane (ou de Henri, Michaelis et Menten) afin d'obtenir l'équation d'une droite.