ENZYMOLOGIE

Historique - site actif - complexe enzyme/substrat - état de transition - protéases

1. Historique

2. Spécificité de l'association protéine - ligand - le site actif - les classes d'enzymes (E.C. X.X.X.X)

3. Lecomplexe enzyme - substrat

4. Etat de transition, énergie libre d'activation et énergie libre de la réaction enzymatique

a. Généralités

b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'état de transition et l'accélération de la réaction par franchissement de la barrière d'activation.

c. voir une animation

5. Illustration des protéases

a. Généralités

b. Les protéases à sérine

6. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

Annexe : distinction entre concentrations à l'équilibre et à l'état stationnaire

1. Historique.

Les organismes vivants sont le siège d'un grand nombre de réactions biochimiques très diverses.

Ces réactions s'effectuent dans des conditions où, normalement, elles ne pourraient se faire. Si elles ont lieu, c'est parce qu'elles sont catalysées par des macromolécules biologiques : les enzymes.

Le pouvoir de catalyse des enzymes est lié, entre autre, à la très haute spécificité de reconnaissance des molécules sur lesquelles elles agissent.

L'enzymologie est la partie de la biochimie qui étudie les propriétés structurales et fonctionnelles des enzymes (la relation structure - fonction).

En particulier, elle s'applique à décrire la vitesse des réactions catalysées par les enzymes.

1783 : Lazzaro Spallanzani a rapporté que la viande est liquéfiée par un extrait gastrique. Il a noté également que la température a un grand effet.

1814 : M. Kirchhoff observa qu'un composant "glutineux" (comme il l'a appelé à l'époque) de blé convertit l'amidon en sucre.

1833 : La première découverte d'une enzyme est d'habitude attribuée à Anselme Payen et Jean-François Persoz qui ont traité un extrait aqueux de malt à l'éthanol puis précipité une substance labile à la chaleur qui hydrolyse l'amidon.

Ils ont appelé cette fraction "diastase" ("séparation" en Grec) puisque cette fraction sépare le sucre soluble de l'amidon insoluble. On sait maintenant que cette préparation était une solution non purifiée d'amylase.

1834 : Theodor Schwann a obtenu le premier un agent actif d'origine animale (la pepsine) qu'il a partiellement purifiée en traitant la paroi stomacale par l'acide.

Il est important de souligner qu'à l'époque les premières observations d'activité enzymatique ont précédé une notion claire et précise de la catalyse. Le concept de catalyse provient de l'observation de l'action de la diastase et de la pepsine parallèlement à celle de la levure pendant la fermentation : dans tous les cas, une "substance était changée en une autre" sous l'influence d'un agent actif : le catalyseur.

A l'époque, la levure n'était pas encore considérée comme une cellule vivante.

1838 : Charles Cagniard de Latour montra que le processus de fermentation est dû à des organismes vivants.

1858 à 1871 : Les travaux de Louis Pasteur confirmèrent cette idée. Pasteur émit l'hypothèse révolutionnaire que les changements chimiques lors de la fermentation résultaient des processus de la vie des micro-organismes impliqués dans la fermentation.

A l'opposé, Justus von Liebig privilégiait une théorie purement chimique : un "ferment" était une substance chimique produite par un organisme en décomposition et les atomes de ce ferment étaient supposés en mouvement incessant. Cet état d'agitation élevé était transmis aux atomes de la molécule de sucre (substrat du ferment) dont les éléments devaient être maintenus par des forces faibles. Il en résultait une scission du sucre en CO₂ et éthanol dont les liaisons étaient plus fortes.

1860 : Marcellin Berthelot fit macérer de la levure et obtint une fraction précipitable à l'alcool capable de convertir le sucrose en glucose plus fructose. Il conclut que l'invertase (nom qu'il donna à l'agent actif de cet extrait) était l'un des multiples ferments présents dans la levure. L'invertase est la β-fructofuranosidase (E.C. 3.2.1.26).

1878 : Wilhelm Kühne proposa le nom d'enzyme ("En-" et "zumê", signifiant "dans le levain") pour qualifier ces ferments. L'addition du ssuffixe "ase" au nom du substrat d'une enzyme pour dénommer cette enzyme fût proposé par Emile Duclaux en 1898.

1897 : Un chimiste allemand, Martin Hahn, tentait d'isoler des protéines de levure (Saccharomyces cerevisiae) en broyant ces levures dans un mortier avec du sable fin et de terre de diatomées. Cependant, cette préparation d'extrait de levure se conservait mal.

Hans et Eduard Buchner s'intéressaient aussi aux extraits de levure dans un but thérapeutique. Ces extraits étant destinés à l'homme ne pouvaient contenir des bactéricides. Se souvenant que le sucre permet de conserver les fruits, Hans Buchner, proposa d'ajouter du saccharose à l'extrait de levure pour le conserver.
Eduard Buchner observa que l'adjonction de sucre entraînait la formation de bulles dans le mélange. Il conclut à la fermentation, processus décrit par Louis Pasteur comme "la vie à l'abris de l'air".

En publiant ses observations, Eduard Buchner concluait : "La complexité de la levure n'est pas indispensable au déroulement de ce processus. Le ferment actif du jus n'est probablement qu'une substance dissoute, sans aucun doute une protéine : nous la baptiserons zymase". Pour cette découverte, Eduard Buchner reçut le Prix Nobel en 1907.

On sait maintenant que la "zymase" des extraits de levure est en fait un mélange d'enzymes dont l'ensemble catalyse les réactions de la glycolyse.

1897 : La même année, Gabriel Bertrand observa que certaines enzymes requièrent des facteurs dialysables pour leur activit. Il les nomma coenzymes.

Au début du 20è siècle, de gros travaux furent entrepris pour purifier des enzymes et surtout décrire leur activité catalytique en termes mathématiques.

1902 : V. Henri et Adrian Brown suggérèrent indépendamment que la formation d'un complexe enzyme - substrat est un intermédiaire obligatoire de la réaction enzymatique.

Cette suggestion s'appuyait sur la forme de la courbe obtenue quand on reporte la vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration en substrat. A. Brown avait étudié la vitesse d'hydrolyse du sucrose par la β-fructofuranosidase, l'invertase de la levure.

De plus cette suggestion était en accord avec le concept de reconnaissance enzyme - substrat du type "clé - serrure" proposé par Emil Fisher en 1894.

Henri fût donc le premier à décrire l'équation mathématique reliant l'effet de la concentration du substrat à la vitesse de catalyse.

1913 : Leonor Michaelis et Maud Menten redécouvrirent l'équation de V. Henri et établirent la relation connue sous le nom d'équation de Henri - Michaelis - Menten.

Le point important est que l'obtention de cette équation repose sur l'hypothèse qu'il s'établit un équilibre rapide entre les concentrations de l'enzyme, du substrat et du complexe enzyme - substrat (E + S <==> ES).

1925 : George Briggs et James Haldane généralisèrent l'équation précédente en introduisant le concept d'état stationnaire pour la concentration du complexe enzyme - substrat.

Le fait que les enzymes sont des protéines ne fût accepté qu'à partir de la fin des années 20.

De nouvelles techniques chimiques et physiques furent employées pour analyser la structure des protéines.

1926 : James Sumner (Prix Nobel en 1946) cristallisât l'uréase.

Années 30 : John Northrop (Prix Nobel en 1946) et ses collaborateurs cristallisèrent le pepsinogène, la pepsine et plusieurs isoformes de la trypsine et de la chymotrypsine et démontrèrent la pureté des cristaux obtenus.

Années 40 et 50 : Des centaines d'enzymes furent purifiées et cristallisées permettant ainsi l'élucidation de dizaines de voies métaboliques.

1955 : Frédéric Sanger (1er Prix Nobel en 1958) publia la séquence complète en acides aminés d'une petite protéine : l'insuline (masse molaire 6000 Da).

1957 : La première structure cristallographique d'une protéine (la myoglobine), déduite de la diffraction des rayons X, fût obtenue par John Kendrew (Prix Nobel en 1962 avec Max Perutz).

Années 60 : La première séquence d'une enzyme (la ribonucléase, masse molaire 13700 Da) fût publiée en 1960 et la première synthèse chimique (également de la ribonucléase) fût obtenue en 1969.

Les biochimistes focalisèrent alors sur le mécanisme de l'activité enzymatique et son mode de régulation.

1958 : Daniel Koshland a proposé le modèle de l'ajustement induit.  Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme.

1961 : Christian Anfinsen (Prix Nobel en 1972) et ses collaborateurs ont montré que, pour un grand nombre de protéines, c'est la séquence en acides aminés qui détermine le repliement de la chaîne polypeptidique dans son unique conformation native donc active. Cette conformation est la plus stable parce qu'elle a une énergie libre minimale.

1963 : Cleland proposa une procédure claire et uniforme pour écrire les équations des cinétiques des systèmes enzymatiques à plusieurs substrats.

1965 : Jacques Monod (Prix Nobel en 1965), Jeffries Wyman et Jean-Pierre Changeux proposèrent un modèle cinétique (modèle MWC) pour les enzymes allostériques (enzymes dont la courbe de vitesse en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïdale et non une hyperbole).

1966 : Daniel Koshland, Georges Nemethy et D. Filmer généralisèrent le modèle précédent (modèle KNF) en incluant la notion d'ajustement induit proposé par Koshland.

Années 80 à nos jours :

L'hypothèse de C. Anfinsen, vérifiée pour un grand nombre de protéines (notamment dites "globulaires") est restée longtemps l'un des dogmes de la biologie.

Cependant, à partir des années 1980, 2 autres processus ont été mis en évidence :

- les protéines chaperones (Ron Laskey - 1978; John Ellis - 1987) aident au repliement de certaines protéines ou les maintiennent dans la conformation native quand la cellule est soumise à certains stress. Parmi les chaperonnes, on peut citer :

• les protéines de choc thermique ("Heat Shock Protein" - HSP)
• les chaperonines
• les protéines LEA ("Late Abundant Embryogenesis")

- les protéines intrinsèquement non structurées : elles n'ont pas de structure tridimensionnelle à l'état libre et n'acquière leur structure repliée, donc fonctionnelle, que quand elles interagissent avec leurs partenaires cellulaires.

Des approches plus récentes et plus vastes sont venues compléter les connaissances acquises pendant plus d'un siècle :

• le développement de divers modèles du repliement de la chaine polypeptidique (exemple : "molten globule" - Wada & Ohgushi, 1983).

• en parallèle, les moyens informatiques de plus en plus puissants ont permis de développer des simulations utilisant la modélisation moléculaire, la mécanique moléculaire ou la dynamique moléculaire (GROMACS, méthode de Monte-Carlo, méthode ab-initio, ...).

• des disciplines naissantes viennent compléter les connaissances acquises en enzymologie : la génomique structurale, la génomique fonctionnelle, la protéomique, la métabolomique.

• enfin, le développement d'Internet, la création de bases de données de plus en plus complètes et spécialisées et la bioinformatique constituent autant d'outils modernes pour développer les moyens d'étude en enzymologie.

2. Spécificité de l'association protéine - ligand - le site actif

Quels sont les facteurs qui expliquent l'extrême spécificité de la reconnaissance entre une protéine et un ligand  ?

a. Toutes les protéines (sauf les protéines intrinsèquement non structurées) se replient dans une conformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquièrent leur activité biologique (leur pouvoir de catalyseur dans le cas des enzymes).

Ce repliement aboutit à une structure tridimensionnelle fonctionnelle unique de la protéine.

b. Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière, le site actif (souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter elle aussi une structure spatiale qui est reconnue par le ligand spécifique de la protéine (et, le cas échéant, par un petit nombre de molécules dont la structure est proche de celle du ligand).

c. Le site actif est constitué d'un petit nombre d'acides aminés qui le plus souvent ne sont pas contigus dans l'enchaînement de la chaîne polypeptidique.

Ces acides aminés sont caractérisés par une chaîne latérale dont à la fois la nature chimique (groupement ionisable ou polarisable) et la structure (encombrement stérique) sont spécifiquement adaptés à la reconnaissance du (ou des) ligand(s).

La stéréochimie qui résulte de cet agencement unique des acides aminés qui constituent le site actif est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance entre ces acides aminés et le (ou les) ligand(s).

Source : Enzyme Mechanisms

d. Les enzymes ne fixent pas seulement un ligand (qui dans ce cas s'appelle un substrat). Elles le transforment en un produit lors d'une réaction chimique. Certains acides aminés du site actif ont pour fonction, non pas de fixer le substrat, mais de fournir les groupements chimiques nécessaires à la réaction catalysée par l'enzyme.

Dans le cas des enzymes, on distingue donc au sein du site actif :

• les acides aminés qui constituent le site de fixation (ces acides aminés n'ont pas de fonction chimique impliquées dans la réaction)
• les acides aminés qui constituent le site catalytique

On peut citer divers types d'association entre une protéine et un ligand :

• les complexes enzyme - substrat
• enzyme - régulateur (inhibiteur, activateur ...)
• antigène - anticorps
• histones - ADN
• récepteurs - hormones

                PL <====> P + L

                           k_-1

* k₁ : constante de vitesse du second ordre (réaction bimoléculaire) - unités : mol.L^-1.s^-1 ou M.s^-1

* k_-1 : constante de vitesse du premier ordre (réaction monomoléculaire) - unités : s^-1

On définit la constante de dissociation (constante macroscopique) qui lie la concentration des composés impliqués dans la réaction :

La classification établie par la commission des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (sigle anglais "IUBMB") a été établie sur des critères de spécificité.

La nomemclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X (E.C. : "Enzyme Commission").

La liste de toutes les enzymes, leur nomenclature et leur identifiant EC décrites par est à : Enzyme Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions

Considérons le groupe 1 des oxydoréductases :

le 2ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction de la nature du groupe du donneur d'électrons sur lequel l'enzyme agit.

Considérons le groupe 1.4 des oxydoréductases qui agissent sur le groupe CH-NH2 du donneur d'électrons :

le 3ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction de la nature du groupe accepteur d'électrons sur lequel l'enzyme agit.

Considérons le groupe 1.4.1 des oxydoréductases qui utilisent le NAD+ ou le NADP+ comme accepteur d'électrons :

le 4ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction du substrat sur lequel l'enzyme agit.

L'exemple de la glutamate déshydrogénase (E. C. 1.4.1.2, E. C. 1.4.1.3 et E. C. 1.4.1.4 met en évidence la notion d'isoenzymes ou d'isoformes de la "même" enzyme.

Voir la base de données : ExplorEnz - The Enzyme Database

3. Le complexe enzyme - substrat

La formation initiale d'un complexe enzyme - substrat E-S, NON covalent, fût suggérée d'après les observations suivantes :

• Le haut degré de spécificité de la reconnaissance d'un substrat par le site actif d'une enzyme. Pour l'expliquer, Emil Fisher suggéra en 1894 que cette reconnaissance résulte d'une très forte complémentarité des structures (mais aussi de la nature chimique des groupements réactionnels) du substrat et de l'enzyme qui le fixe, comme le sont une clé et la serrure dans laquelle elle entre.

• La forme de la courbe dite de saturation : vitesse initiale de la réaction enzymatique en fonction de la concentration en substrat (vi = f([S]) (V. Henri, 1902 ; Adrian Brown, 1902).

• Le fait que les substrats protègent souvent les enzymes de l'inactivation (O'Sullivan & Tompson, 1890).

L'hypothèse "clé -serrure", bien qu'extrêmement satisfaisante, ne peut rendre compte de certaines observations :

• Par exemple, certains composés qui ressemblent chimiquement à un substrat mais qui ont des groupements moins volumineux ne sont pas catalysés, bien qu'ils doivent encore mieux s'insérer dans le site actif.

• Il existe un mécanisme enzymatique à deux substrats appelé "fixation ordonnée" pour lequel un substrat B ne peut se fixer que si le substrat A l'est déjà. Or, selon l'hypothèse "clé - serrure", le substrat B devrait se fixer d'emblée.

Diverses théories ont été proposées pour expliquer les modifications structurales du substrat et/ou de l'enzyme lors de leur association.

a. Henry Eyring et Rufus Lumry (1954) ont proposé le modèle appelé "rack" (traduction : chevalet de torture ; tourmenter).

C'est le substrat qui subit un changement conformationnel, la structure de l'enzyme étant considérée comme rigide.

Le résultat est un accroissement de la labilité des liaisons à rompre dans la molécule de substrat puisque celui-ci, bien que fixé de manière lâche, subit des tensions dans ses liaisons qui l'amènent dans une configuration proche de celle de l'état de transition.

b. Daniel Koshland (1958) a proposé le modèle de l'ajustement induit.

Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme. Les orbitales des groupements catalytiques et du groupement réactionnel du substrat sont alignées de manière optimale pour l'acte catalytique (voir article). A l'inverse, des molécules qui ont une structure analogue à celle du substrat peuvent se fixer mais l'orientation spatiale des groupements ne permet pas l'acte catalytique

Pour un mécanisme ordonné à deux substrats, la fixation du premier est supposée induire un changement de conformation qui révèle le site de fixation du second substrat.

Par exemple, l'hexokinase de levure se replie en deux domaines structuraux reliés par une région flexible appelée "charnière". Cette enzyme catalyse la phosphorylation (par l'ATP) du glucose en glucose-6-phosphate. Quand elle fixe le glucose, l'hexokinase subit un profond changement de conformation : les deux domaines se rapprochent l'un de l'autre par un mouvement d'environ 12°, ce qui augmente l'hydrophobicité du site actif et prévient l'hydrolyse de l'ATP.

c. Williams Jenks (1966) a proposé le modèle appelé "strain" (tension ; déformation).

C'est une combinaison des deux théories qui précèdent. Les changements de conformation de l'enzyme entraînent des contraintes dans la structure du substrat.

4. Etat de transition, énergie libre d'activation et énergie libre de la réaction enzymatique - voir une animation

a. Généralité

Un substrat et un produit d'une réaction enzymatique sont caractérisés par des liaisons chimiques.

Au cours d'une réaction, des échanges d'énergie avec le milieu environnant ont lieu : certaines liaisons du substrat sont rompues en absorbant de l'énergie et les liaisons du produit sont formées en libérant de l'énergie.

Dans le cas d'une réaction exergonique, l'énergie nécessaire pour rompre les liaisons du substrat est inférieure à l'énergie libérée lors de la formation des liaisons du produit. L'énergie requise pour que la réaction ait lieu (l'énergie nécessaire pour que les liaisons du substrat soient rompues) s'appelle l'énergie libre d'activation : ΔG^#.

Lors de l'absorption de cette énergie, la vitesse des molécules de substrats augmente et donc la fréquence et le nombre de collisions entre molécules de substrats et d'enzyme augmentent aussi. Parallèlement, l'augmentation de l'agitation thermique fragilise les liaisons qui sont donc plus faciles à rompre.

Eyring a proposé la théorie de l'état de transition en 1935 : quand toute l'énergie d'activation est absorbée, la molécule de substrat est dans l'état de transition (les angles et les longueurs des liaisons chimiques du substrat sont distordues). C'est l'état le plus énergétique, donc le plus instable. La réaction évolue spontanément vers un état énergétique plus faible, la formation du produit de la réaction.

Pour sa part, la différence d'énergie libre de Gibbs entre les produits et les substrats est la variation d'énergie libre de Gibbs de la réaction : ΔG^réaction.

Il faut noter que même dans le cas d'une réaction exergonique, les substrats doivent franchir la barrière d'activation. Cette barrière est essentielle pour la vie : sans elle, les macromolécules (protéines, acides nucléiques ...) à fort potentiel énergétique se décomposeraient spontanément.

Dans les conditions de la vie cellulaire, peu de molécule peuvent franchir la barrière d'activation dans un laps de temps compatible avec les processus biologiques. Par exemple, le demi-temps de désamination de l'adénosine à 20°C et à pH7 est d'environ 20.000 ans !

Seule l'intervention d'un catalyseur biologique, une enzyme, le permet.

Une enzyme augmente la vitesse de la réaction en abaissant l'énergie d'activation : à la même température, les substrats franchissent plus facilement et donc plus fréquemment la barrière d'activation.

En conclusion :

• les enzymes ne modifient pas la variation d'énergie libre de Gibbs de la réaction : la constante d'équilibre de dissociation (K_dissociation) d'une réaction n'est pas modifiée.
• en revanche, les constantes de vitesse microscopiques (k₁ et k_-1) sont modifiées dans le même rapport.

b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'état de transition et l'accélération de la réaction par franchissement de la barrière d'activation.

Voir un trés bon cours : Enzyme Mechanisms

L'état de transition est un arrangement de liaisons chimiques en train de se former et de se rompre puisque c'est une structure intermédiaire entre celle du substrat dont il est issu et celle du produit qu'il va former.

L'état de transition est donc une structure hautement énergétique donc instable.

La vitesse d'une réaction enzymatique dépend de l'efficacité de la rencontre / collision entre les molécules qui vont former l'état de transition.

Cette efficacité dépend à la fois :

• de l'orientation des molécules l'une par rapport à l'autre
• d'une énergie minimale requise appelée énergie d'activation

1er facteur : les deux grands types chimiques de mécanismes catalytiques

α. La catalyse acide-base générale : c'est le mécanisme le plus courant de la catalyse enzymatique. L'accélération de la réaction résulte du transfert d'un proton.

Par exemple, ce proton peut provenir du couple imidazole / imidazolium de la chaîne latérale de l'histidine puisqu'elle a un pKa situé entre 6 et 7 et constitue au pH physiologique un groupe donneur / accepteur de proton.

L'activité catalytique des enzymes de ce type est largement influencée par le pH.

Exemples de groupes fonctionnels d'acides aminés qui peuvent agir en tant que catalyseur acide/base :

• groupement imidazole de His
• groupement α-aminé
• groupement α-carboxylique
• groupement thiol de Cys
• groupement carboxylique de la chaine latérale de Glu et Asp
• groupement ε-aminé de Lys
• groupement aromatique OH de Tyr
• groupement guanidino de Arg

β. La catalyse par covalence (aussi appelée catalyse nucléophile) : elle concerne essentiellement les réactions enzymatiques où plusieurs substrats sont impliqués (environ 20% des enzymes et toutes les enzymes à mécanisme à 2 substrats de type "ping-pong").

Une partie du premier substrat est transférée à l'enzyme via la formation d'une liaison covalente puis cette partie du substrat est transférée au second substrat.

2ème facteur : l'effet de voisinage

La fixation d'une molécule de substrat au site actif d'une enzyme augmente la concentration effective du substrat par rapport à sa concentration à l'état libre en solution.

Les molécules ne sont plus assujetties au hasard de collisions suffisament énergétiques.

Cet accroissement de concentration augmente la fréquence de formation de l'état de transition.

3ème facteur : la fixation préférentielle de l'état de transition

L'enzyme fixe plus fortement l'état de transition que le substrat ou le produit pour des raisons de contrainte ou de distorsion.

L'état de transition s'ajuste mieux et établit davantage de contacts avec les résidus d'acides aminés du site actif.

C'est trés probablement l'enzyme qui subit des changements de conformation (voir ajustement induit) car il est peu probable qu'il y ait suffisament d'énergie dans la fixation du substrat pour en contraindre la structure.

4ème facteur : la stabilisation de l'état de transition

Quand le complexe enzyme - substrat est formé, il est en équilibre avec sa forme activée (c'est-à-dire, le complexe enzyme - état de transition, ES^#).

La stabilisation de l'état de transition déplace l'équilibre en faveur de ES^# et en même temps abaisse l'énergie d'activation.

Il est important de noter que ce phénomène exige une fixation lâche du substrat (attention : pas une fixation lâche de l'état de transition !) à l'enzyme car une fixation trop forte irait à l'encontre de la catalyse.

L'enzyme doit donc maintenir le substrat en place tant que l'état de transition n'est pas atteint mais sans l'immobiliser. Si tel était le cas, le complexe ES formé serait trop stable pour atteindre sa configuration de l'état de transition (ES^#).

Quand le substrat se fixe à l'enzyme, les molécules d'eau sont de manière générale "exclues" du site actif (effet de désolvatation).

• la constante diélectrique "locale" est donc abaissée ce qui accroit les forces d'interaction électrostatiques au niveau du site actif.
• cette exclusion protège les groupements réactifs de réactions parallèles avec l'eau.

Un cas particulier est l'eau qui agit comme substrat (exemple des protéases à sérine).

L'ensemble de ces facteurs rend compte des valeurs d'accélération couramment observées avec les enzymes comme l'indique le tableau suivant :

5. Illustration des protéases

a. Généralités

Les protéines ou les peptides sont hydrolysées en fragments peptidiques par des protéases.

Il en existe plusieurs familles constituées d'un trés grand nombre d'enzymes :

• trypsine (EC 3.4.21.4)
• LysC
• thrombine
• chymotrypsine
• élastase
• subtilisine
• cathepsine
• kallikréine
• prostasine
• granzyme
• facteurs VIIa, IXa, Xa et XIIa de la coagulation

et bien d'autres ...

• aminopeptidases A, B, N, O
• carboxypeptidases A1 à A6, B, E, M, N, U
• angiotensin-converting-enzyme 2
• peptidases (hydrolyse de peptides tels que des neurotransmetteurs)

et bien d'autres ...

• pepsines A, A4, A5
• retropepsines de de rétrovirus
• chymosine
• rénine
• cathepsines D, E

et bien d'autres ...

• cathepsines B, F, H, K, L, O, S, V, W, X
• calpaïnes 1 à 15
• caspases 1 à 10
• ubiquitinyl hydrolases
• ubiquitinyl-spécific peptidases 1 à 54
• secernine

et bien d'autres ...

• sous-unités catalytiques du protéasome
• taspase
• asparaginase

et bien d'autres ...

Toutes les informations fonctionnelles (spécificité des substrats, inhibiteurs, séquences et autres) et structurales sont recensées dans les bases de données :

• The Proteolysis Map
• The MEROPS database

b. Les protéases à sérine

Les deux familles de protéases à sérine ("chymotrypsin-like" et subtilisin-like") contiennent entre autres : la trypsine, la chymotrypsine, l'élastase, la subtilisine (voir tableau ci-dessus).

Ce sont les enzymes qui ont probablement été le plus étudiées tant du point de vue du mécanisme catalytique (voir ci-dessous) avec un trés grand nombre d'inhibiteurs de toutes sortes, que du point de vue structural.

Par exemple, on dénombre plus de 900 structures cristallographiques liées à la trypsine (trypsine, trypsinogène, Kunitz trypsin inhibitor, ...).

Les protéases à sérine sont biosynthètisées sour forme d'un précurseur inactif, le zymogène, qui est activé par coupure protéolytique par des protéases (à sérine pour certaines).

Les protéases à sérine sont essentiellement des endopeptidases. Elles hydrolysent la liaison peptidique en fonction de la nature de certains acides aminés.

Par exemple, la trypsine hydrolyse la liaison peptidique après (côté C-terminal) les acides aminés lysine et arginine sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline.

Cependant les protéases à sérine peuvent avoir une spécificité très complexe.

• Voir le logiciel "PeptideCutter" - Expasy.

• Aller à la page "MS-Digest" du logiciel "Prospector". Cliquer sur "perform digest" pour avoir un aperçu d'un résultat d'hydrolyse in silico d'une protéine.

• Voir la liste de certaines protéases et leur spécificité : "Expasy".

c. Les acides aminés du site catalytique des protéases à sérine : la "triade" catalytique

Les protéases à sérine possèdent une sérine 195 réactive dans leur site actif.

Deux autres acides aminés sont impliqués dans la catalyse par les protéases à sérine : l'histidine 57 et l'aspartate 102.

Les protéases à sérine utilisent les deux types de catalyse :

• l'histidine 57 sert de catalyseur acide-base. On estime que les acides aminés mis en jeu dans la catalyse acide - base accélèrent de 10 à 100 fois les réactions enzymatiques par rapport à la vitesse de la même réaction non catalysée par une enzyme.

• la sérine 195 sert de catalyseur par covalence avec un carbone de la liaison peptidique qui va être clivée. L'accélération par la catalyse covalente est du même ordre de grandeur.

source : E. Jaspard (2011) - Image réalisée avec CHIMERA - UCSF

Visualisation de la triade catalytique dans la forme acyl-enzyme de l'élastase pancréatique à une résolution de 0,95 Å.

Code PDB : 1GVK

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

6. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

Voir un trés bon cours : Enzyme Mechanisms

La protéase fixe le substrat (protéine ou peptide) dont elle hydrolyse la liaison peptidique au niveau d'acides aminés spécifiques de la protéase considérée.

La chaîne latérale R1 de l'acide aminé impliqué dans l'hydrolyse de la liaison peptidique est de nature aromatique ou encombrante (dans le cas de la trypsine) mais de toute autre nature pour d'autres types de protéases.

Cette chaîne latérale se fixe dans un endroit particulier du site actif de la protéase appelée "poche de spécificité" ("specificity pocket") de caractère hydrophobe.

Cette fixation optimise l'orientation stéréochimique de la liaison peptidique afin qu'elle soit hydrolysée du côté C-terminal (carboxyle) du résidu d'acide aminé.

Le squelette carboné du polypeptide substrat forme un court feuillet β avec le squelette carboné de l'enzyme au niveau du site actif (non montré dans la figure).

L'oxygène du groupement carbonyle du substrat forme une liaison hydrogène avec un groupement NH- (amide) du squelette carboné de l'enzyme (non montré dans la figure).

Le complexe enzyme-substrat (ES) est ainsi formé.

2ème étape : acylation / formation du premier intermédiaire tétrahédrique

L'oxygène du groupement OH de la Ser 195 du site actif est activé en formant une liaison hydrogène avec l'azote N: du noyau imidazole de l'His 57. His 57 agit comme un accepteur de proton de Ser 195, selon un mécanisme de catalyse base générale, et devient His-H+.

En même temps, l'oxygène Ser-O devient nucléophile et attaque le C du groupement carbonyle de la liaison petidique à hydrolyser. Une liaison covalente est ainsi formée selon le mécanisme de catalyse par covalence.

Asp 102 a pour rôle le maintien d'un arrangement stéréospécifique idéal du réseau de liaisons hydrogène établi entre His 57 et Ser 195. Il stabilise aussi la forme HisH+ par interaction électrostatique ce qui facilite le transfert du proton.

Le résultat de cette étape dite d'acylation est la formation du premier intermédiaire tétrahédrique dont la structure est probablement semblable à celle de l'état de transition (ES^#) avec un oxygène carbonyle négatif appelé l'oxyanion. Le site actif fixe plus fortement l'oxyanion qu'il ne fixe le groupement carbonyle original du substrat : l'état de transition est ainsi stabilisé.

Une autre liaison hydrogène est établie entre l'oxyanion et un groupement NH- du squelette carboné de l'enzyme (au niveau de Gly 193) situé dans une région appelée "trou oxyanion".

3ème étape : acylation (formation de l'acyl-enzyme) / libération du produit P1

La liaison peptidique originelle est clivée : His-H+ cède un proton à la moitié "amino" du substrat d'origine et agit selon un mécanisme de catalyse acide générale.

Cette partie aminée est dissociée du site actif et le produit P1 (R2NH2) est libéré.

L'oxyanion redevient C=O qui reste attaché de manière covalente à Ser 195.

C'est l'intermédiaire acyl-enzyme fixé par une liaison ester entre la moitié "carbonyle" du substrat d'origine et l'oxygène de la fonction alcool de Ser 195.

4ème étape : désacylation / formation du second intermédiaire tétrahédrique

Le second substrat, la molécule d'eau, forme une liaison hydrogène avec HisN: et His 57 agit de nouveau selon un mécanisme de catalyse base générale, et devient HisH+.

L'oxygène de l'eau est activé ce qui le rend nucléophile : il attaque le C du groupe carbonyle de l'acyl-enzyme (catalyse par covalence).

Asp 102 a pour rôle le maintien d'un arrangement stéréospécifique idéal du réseau de liaisons hydrogène établi entre His 57 et Ser 195. Il stabilise aussi la forme HisH+ par interaction électrostatique ce qui facilite le transfert du proton.

Le résultat de cette étape est la formation du second intermédiaire tétrahédrique (groupement -OH au lieu d'un groupement amide dans le cas du premier) dont la structure est probablement semblable à celle de l'état de transition (ES^#) avec un oxygène carbonyle négatif (oxyanion).

Le site actif fixe plus fortement l'oxyanion qu'il ne fixe le groupement carbonyle original du substrat : l'état de transition est ainsi stabilisé.

De nouveau, une autre liaison hydrogène est établie entre l'oxyanion et un groupement NH- de Gly 193 situé dans le "trou oxyanion".

5ème étape : désacylation / libération de P2 / reformation de E

His-H+ redonne son proton à l'oxygène de la fonction alcool de Ser 195 de l'acyl-enzyme.

La liaison ester est clivée, libérant le produit P2 : R1COOH = la partie N-terminale du substrat d'origine).

Les 3 acides aminés de la triade catalytique retrouvent leur état initial.

L'enzyme sous forme E est prête à catalyser de nouveau cette réaction.

Schémas réalisés avec ChemBioDraw®.