1. Introduction

2. Les miRNA

3. Le complexe Drosha - Pasha

4. Le complexe RISC ("RNA-Induced Silencing Complex")

5. La RNAse DICER

6. La dégradation des siRNA ou miRNA

7. Les protéines Argonaute (Ago)

8. Le domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille)

9. Liens Internet et références bibliographiques

L'interférence ARN ("RNA interference" ou "gene silencing", historiquement appelée "co-suppression", "post transcriptional gene silencing" - PTGS chez les plantes ou "quelling" dans le cas des Fungi) est une voie de régulation du taux de traduction des ARN messagers ou plus précisément de l'expression post-transcriptionnelle des gènes.

Andrew Fire et Craig Mello ont obtenu le Prix Nobel en 2006 pour la découverte de ce mécanisme ("RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA") chez le nématode Caenorhabditis elegans (travaux publiés en 1998).

Ce mécanisme a été probablement sélectionné au cours de l'évolution pour prémunir les cellules contre l'introduction de gènes (en particulier de virus ou de transposons). Il permet également de nettoyer la cellule d'ARNm non fonctionnels.

Ce mécanisme s'est avéré très utile pour décrypter la fonction de gènes chez le nématode puis chez d'autres organismes, notamment les mammifères (travaux de Elbashir et al., 2001)

C'est un ensemble de mécanismes qui aboutit à l'interférence entre un ARN simple ou double brin dit interférant ("RNAi") avec un ARN messager (ARNm) spécifique.

L'ARNm est dégradé et la traduction de cet ARNm en protéine est donc diminuée.

Source : Qiagen

Les ARN double brin ("double-stranded RNA" - dsRNA) correspondant à un gène spécifique, sont clivés tous les 21 à 25 nucléotides par une ribonucléase de type III appelée DICER ("éminceuse").

Les courts fragments dsRNA obtenus sont appelés petits ARN interférents ("small interfering RNA" - siRNA). Les précurseurs des siRNA sont appelés "short hairpin RNA" - shRNA.

La ribonucléase DICER transfère les siRNA à un complexe multienzymatique : "RNA-Induced Silencing Complex" - RISC.

L'un des brins du siRNA (appelé "passager") est éliminé et l'autre brin (appelé "guide") dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire du brin guide.

Si le siRNA et l'ARNm cible sont parfaitement complémentaires, le complexe RISC hydrolyse l'ARNm qui n'est plus traduit en protéine.

Quelques bases non complémentaires suffisent à empêcher le clivage de l'ARNm : ce mécanisme est donc très spécifique des séquences du siRNA et de sa cible ARNm (voir la base de données "RNAi Atlas").

Les ARN et les petits ARN ("small RNAs" : snRNA, snoRNA, siRNA, miRNA, piRNA "Piwi-interacting RNAs"), ...) de 20 à 30 nucléotides.

Ils participent à divers mécanismes génétiques, physiologiques et métaboliques.

Source : Buckingham S. (2003)

2. Les miRNA (micro-RNA)

Les miRNA sont endogènes : ils sont synthétisés dans le noyau sous forme de pri-miRNA ("primary-miRNA") à partir des gènes (poly-cistrons) miRNA transcrits par l'ARN polymérase II ou III.

Les pri-miRNA ont une coiffe en 5' comme l'indique l'existence d'un site de fixation à eIF4E. Le facteur eIF2C2 ("Eukaryotic Translation Initiation Factor-2C2") participe aussi à ce processus.

Les pri-miRNA ont une structure en épingle à cheveux ("hairpin").

Les extrémités 3' et 5' des pri-miRNA sont alors clivées par un complexe enzymatique formé par Drosha (ribonucléase de type III) et DGCR8 ("DiGeorge syndrome critical region 8").

Les fragments formés (environ 70 nucléotides - structure en épingle à cheveux) sont appelés pre-miRNA.

Source : Qiagen

Les pre-miRNA sont alors exportés dans le cytoplasme via les exportines 5 (chez les animaux) complexées à Ran-GTP.

Dans le cytoplasme, les pre-miRNA sont clivés par le complexe DICER/TRBP et la boucle de l'épingle est enlevée.

Des protéines de type hélicase associées à DICER dissocient le dsRNA en deux ARN simple brin : on aboutit aux miRNA (21 à 24 nucléotides) qui ont une séquence complémentaire ou partiellement complémentaire de la région 3' UTR ("UnTranslated Region") de l'ARNm cible.

Les miRNA ont 2 bases non appariées à l'extrémité 3'.

Le brin fonctionnel des miRNA est chargé sur le complexe RISC auquel s'associe la protéine Argonaute.

Les miRNA ont été identifiés dans tous les règnes (mammifères, drosophile, C. elegans, plantes …).

Actuellement, 800 miRNA ont été identifiés chez l'homme (bioinformatique, approche génétique, séquençage en masse des petits ARN dans la cellule).

60% des gènes codant des protéines contiendraient des séquences cibles de miRNA à l'extrémité 3'UTR.

Figure ci-contre : Voie des ARN interférant : pri-miRNA, pre-miRNA, miRNA et siRNA.

Source : Qiagen

3. Le complexe Drosha - Pasha

Drosha (EC 3.1.26.3 / Uniprot : Q9NRR4 - homme, Q7KNF1 - Drosophile / PDB : 2KHX ) est une grosse ribonucléase de type III (1320 - 1380 acides aminés selon l'espèce) qui fixe les dsRNA.

Les RNAses de type III ont un motif conservé de 9 acides aminés qui est une signature de leur site catalytique. Drosha en possède deux.

Le domaine de fixation du dsRNA ("dsRNA-Binding Domain" - dsRBD") de Drosha est caractérisé par un repliement αβββα : 1 hélice α (Ser1263 à Thr1271), suivie de 3 feuillets β antiparallèles (Leu1283 à Gly1314), suivie de 1 hélice α (Ile1317 à Lys1331).

Les différents domaines d'enzymes impliquées dans l'interférence ARN.

Armitage et SDE3 (plantes) sont des hélicases d'ARN.

DCR-1 est une RNAse de type III.

Source : Meister & Tuschl (2004)

Drosha forme un complexe enzymatique (appelé "Microprocessor complex") avec DGCR8 ("DiGeorge syndrome critical region 8").

DGCR8 est connue sous le nom de Pasha chez la Drosophile et Caenorhabditis elegans.

Pasha est une dsRBP ("dsRNA-Binding Protein") capapble également de fixer les fragments simple brin des pri-miRNA requis pour une catalyse optimale.

Drosha et Pasha sont localisées dans le noyau.

Source : Krol et al. (2010)

4. Le complexe RISC ("RNA-Induced Silencing Complex")

Le complexe RISC est composé :

• d'une protéine de la famille Argonaute (Ago), une endonucléase qui dégrade les ARNm. Ago possède un domaine PAZ pouvant s'apparier avec le domaine PAZ de DICER via les protéines R2D2 ou R3D1, et un domaine PIWI responsable de l'activité endoribonucléase du complexe RISC.

• d'une hélicase permettant de dissocier les siRNA ou les miRNA double brins.

• la protéine TRBP chez l'homme ou la protéine R2D2 chez la Drosophile se fixent à DICER et recrutent la protéine Argonaute.

• d'autres protéines fixant les dsRNA ("dsRNA Binding Protein") interviennent dans le complexe RISC : RDE-4 et R3D1/Loquacious (appelée par la suite Loqs) interagissent avec DICER1.

Les complexes RISC qui possèdent une protéine Ago1 vont s'associer aux miRNA, alors que ceux qui possèdent une protéine Ago2 sont plus spécifiques des siRNA.

Les siRNA ont 2 bases non appariées à l'extrémité 3'.

Les siRNA doivent être absolument phosphorylés en 5' pour entrer dans le complexe RISC.

L'hydrolyse de l'ATP (domaine hélicase) est indispensable pour désapparier les 2 brins des siRNA.

Une fois désapparié, le brin antisense guide le complexe RISC vers l'ARNm cible.

L'ARNm cible est clivé au centre du duplex formé entre le brin guide siRNA et le brin de l'ARNm cible à une distance de 10 nucléotides de l'extrémité 5' du brin siRNA.

5. La RNAse DICER (EC 3.1.26.3)

DICER1 hydrolyse les pre-miRNA en miRNA et DICER2 hydrolyse les dsRNA en siRNA (de 21 à 25 nucléotides).

La structure de DICER (A8BQJ3 - 754 acides aminés) chez Gardia intestinalis contient 2 domaines RNase III et 1 domaine PAZ.

Chez l'homme, DICER (Q9UPY3 - 1922 acides aminés) contient des domaines supplémentaires : un domaine hélicase, un domaine DUF283 ("Domain of Unknown Function 283") et un domaine de fixation du dsRNA ("dsRNA-Binding Domain" - dsRBD).

La distance entre les domaines RNAses III et PAZ est déterminée par la longueur et l'angle de l'hélice appelée connecteur ("ruler helix") (figure ci-contre).

Des cations magnésium compensent la charge négative du dsRNA et celles des acides aminés de DICER et assurent l'interaction entre la protéine et le dsRNA .

Le site actif de DICER contient une lysine qui semble intervenir dans l'hydrolyse de la liaison phosphodiester du dsRNA.

DICER2 possède une activité ATPase (domaine hélicase). L'hydrolyse de l'ATP est nécessaire pour que DICER2 clive les longs dsRNA.

Source : Macrae et al. (2006)

Visualisation de DICER de Giardia intestinalis à une résolution de 3,33 Å

Code PDB : 2FFL

Le chargement de la structure peut prendre un peu de temps.

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

6. La dégradation des siRNA ou miRNA

Les membres de la superfamille de protéines Argonaute (Ago) sont impliqués dans l'interférence ARN tant au niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel.

Les protéines Ago peuvent être divisées en 3 groupes :

• celles qui fixent les siRNA (dérivés de longs dsARN précurseurs) et les miRNA (dérivés de structures endogènes en épingle à cheveux).
• celles qui fixent les piRNA (protéines PIWI) : ARN qui sont 2'-0-méthylés à l'extémité 3'.
• un 3è groupe décrit uniquement chez les nématodes.

Le complexe [Ago - siRNA] ou [Ago - miRNA] médient ensuite la répression de leurs ARNm cibles de plusieurs manières:

(a) si la complémentarité du siRNA ou du miRNA (porté par l'Ago) avec l'ARNm cible est parfaite, le complexe [Ago - siRNA] ou [Ago - miRNA] dégrade les ARNm cibles (figure de gauche, ci-dessous).

(b) si la complémentarité du miRNA avec l'extrémité 3' non traduite ("3' UTR") de l'ARNm cible est imparfaite, le complexe [Ago - miRNA] :

• inhibe sa traduction (figure du milieu)
• ou induit sa désadénylation puis l'hydrolyse de la coiffe ("5' cap" - m7G : 7-méthylguanine) et enfin la dégradation de l'ARNm cible (figure de droite).

Source : Höck & Meister (2008)

Le complexe miRISC interagit avec le complexe désadénylase CCR4-NOT1 pour la désadénylation de la queue poly(A) [A(n) dans la figure ci-contre].

La désadénylation requière l'interaction de la protéine GW182 avec la protéine PABP ("Poly(A)-Binding Protein") qui fixe la queue poly(A).

Après la désadénylation, la coiffe à l'extrémité 5' (m7G) est enlevé par le complexe DCP1-DCP2.

Source : Fabian et al. (2010)

Légende de la figure ci-dessus :

• Rectangle noir : phase de lecture ouverte ("open reading frame")
• CAF1 : "CCR4-Associated Factor 1"
• CCR4 : "Carbon Catabolite Repression 4 protein"
• NOT1 : "Negative On TATA-less"

7. Les protéines Argonaute (Ago)

Ago a la forme de 2 lobes qui contiennent chacun 2 domaines :

• le domaine N-terminal et le domaine PAZ est également conservé au sein de la famille des protéines Argonaute. Le second contient le site de fixation des 2 nucléotides non appariés à l'extrémité 3' du brin guide.
• le domaine Mid ("Middle") et le domaine PIWI, conservé au sein de la famille des protéines Argonaute. 

Source : Parker J. (2010)

L'extrémité C-terminale du domaine PIWI adopte un repliement de type RNAse H et possède le site catalytique (Asp-Asp-Asp/His - activité endonucléase). La catalyse est médiée par des ions Mg2+.

Le site de clivage de l'ARNm cible est juxtaposé aux acides aminés du site actif du domaine PIWI.

L'extrémité 5' du brin guide se fixe dans une poche du domaine Mid, et l'extrémité 3′ se fixe au domaine PAZ.

Le clivage requière la formation de liaisons du type Watson-Crick entre le brin guide et l'ARNm cible s'étendant de la position 2 jusqu'au site de clivage (position 10–11) en partant de l'extrémité 5′ du brin guide.

Source : Liu & Paroo (2010)

Visualisation de Argonaute de Thermus thermophilus complexée à un fragment d'ADN à une résolution de 2,7 Å

Code PDB : 3DLB

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8. Le domaine PAZ

Ce domaine (PFAM : PF02170) est trouvé dans les 2 familles de protéines impliquées dans l'interférence post-transcriptionnelle : familles PIWI et DICER (incluant le facteur protéique Carpel).

Le nom du domaine PAZ est ainsi appelé d'après les protéines "Piwi", "Argonaut" et "Zwille".

Le domaine PAZ est composé de 2 sous-domaines :

• l'un deux est semblable au repliement OB, impliqué dans la fixation d'acides nucléiques simple brin.
• l'autre est composé d'un coude β suivi d'une hélice α.

Le domaine PAZ peut fixer les 2 nucléotides non appariés en 3' des siRNA et des miRNA : même si ce domaine n'est pas le site principal de fixation au sein de DICER ou du complexe RISC, il contribue à l'incorporation spécifique des siRNA et des miRNA dans la voie de l'interférence ARN.

Wassenegger et al. (1994) "RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants" Cell 76, 567 - 576

Fire et al. (1998) "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans" Nature 391, 806 - 811

Elbashir et al. (2001) "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells" Nature 411, 494 - 498

Macrae et al. (2006) "Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer" Science 311, 195 - 198

Höck & Meister (2008) "The Argonaute protein family" Genome Biology 9, 210 

Wang et al. (2009) "Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in argonaute silencing complexes" Nature 461, 754 - 761

Carthew & Sontheimer (2009) "Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs" Cell 136, 642 - 655