La liaison phosphate la plus énergétique connue (ΔG°' = - 14,8 kcal/mol) est celle du phosphoénolpyruvate (ou PEP), qui est un intermédiaire de la voie de la glycolyse. Le PEP est un énol ester dont l'hydrolyse se déroule en trois étapes :

• (1) il y a d'abord formation d'un anion énolate stabilisé par résonance ;
• (2) cet anion qui est instable est protonné pour donner un énol pyruvate ;
• (3) enfin, il y a tautomérisation entre la forme énol et la forme cétone pour donner le pyruvate.

Source : "Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn et Scrimgeour (1994), Ed. DeBoeck Universités

On peut donc rendre compte du fort caractère énergétique du PEP en considérant que cette molécule correspond à un énol bloqué par le groupe phosphoryle : le départ de ce groupe autorise la molécule à prendre la forme cétone qui est beaucoup plus stable.

Dans la glycolyse, la pyruvate kinase catalyse le transfert du groupe phosphoryle du PEP à l'ADP pour former de l'ATP et du pyruvate. Malgré la formation d'ATP, la réaction est très exergonique : -14,8 - (-7,3) = - 7,5 kcal/mol.

Ce mode de synthèse d'ATP s'appelle phosphorylation au niveau du substrat.

L'autre mode est la synthèse d'ATP par l'ATP synthase à l'issue d'un ensemble de réactions qui ont lieu dans la mitochondrie, la chaîne respiratoire.